異氟烷對新生小鼠神經元細胞外信號調節激酶和cAMP反應元件結合蛋白磷酸化水平的影響

張斌

遼寧省錦州市中心醫院麻醉科，遼寧錦州　121001

異氟烷對新生小鼠神經元細胞外信號調節激酶和cAMP反應元件結合蛋白磷酸化水平的影響

張斌

遼寧省錦州市中心醫院麻醉科，遼寧錦州121001

目的觀察異氟烷對小鼠神經元細胞外信號調節激酶和環磷酸腺苷（cAMP）反應元件結合蛋白磷酸化水平的影響，探究異氟烷誘導神經元損傷和學習記憶障礙的可能機制。方法原代培養小鼠神經元，分為對照組、0.96mmol/L異氟烷處理12 h及24 h組。采用MTS方法檢測各組細胞活力；Western blot方法檢測p-ERK1/2和p-CREB表達情況；逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）方法檢測ERK和CREBmRNA表達。 結果 與對照組比較，0.96 mmol/L異氟烷處理12 h及24 h后神經元活力明顯下降（P＜0.05）；Western blot實驗結果顯示：與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經元中p-ERK1/2和p-CREB表達水平均明顯降低（P＜0.05）；隨著異氟烷處理時間的增加，p-ERK1/2和p-CREB表達逐漸降低，處理12 h與24 h比較差異有統計學意義（P＜0.05）。RT-qPCR實驗顯示：與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經元中ERK和CREBmRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 結論一定濃度的異氟烷可以降低原代培養的小鼠神經元活力和ERK1/2、CREB的磷酸化水平。

異氟烷；神經元；細胞外信號調節激酶；cAMP反應元件結合蛋白

［Abstract］Objective To investigate Isoflurane-induced neuronal damage and possiblemechanisms involved in learning and memory impairments.M ethods Cerebral neurons separated from fetal mice were cultured and divided into three groups，one control group，two experimental groups were treated with 0.96 mmol/L Isoflurane for 12 h and 24 h，respectively.MTSmethod was used to determine the cell viability；Western blotmethod was used to detect p-ERK1/2 and p-CREB expressions；the reverse transcription qPCR（RT-qPCR）method was used to detectmRNA expressions of ERK and CREB.Results Compared with the control group，the viability of neuronal cells decreased significantly（P＜0.05）；the phosphorylation of ERK1/2 and CREB also significantly decreased（P＜0.05），and with the prolonging of Isoflurane treatment duration，the expression of p-ERK1/2 and p-CREB decreased gradually，and the difference between 12 and 24 h after treatmentwas statistically significant（P＜0.05）；there were no statistically significant difference inmRNA expressions of the ERK and CREB（P＞0.05）.Conclusion A certain concentration of Isofluranemay directly inhibitneuronal cell viability and also inhibits the activities of ERK1/2 and CREB.

［Key words］Isoflurane；Neuron；ERKs；CREB

全麻藥異氟烷因其價格便宜、毒副作用小、誘導快，是臨床中應用廣泛的吸入麻醉藥之一。近年來研究表明，異氟烷急性暴露可誘發神經細胞凋亡，引起新生大鼠長期學習記憶能力下降［1-2］；異氟烷還可以引發圍術期成年患者術后認知功能障礙（Post-operative cognitive dysfunction，POCD）并對神經系統發育、學習及記憶產生影響［3］。細胞外信號調節激酶（Extracellular signal regulated kinases，ERKs）是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，介導細胞增殖、分化及存活。在中樞神經系統中，ERK可影響神經細胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長等，與腦內長時程增強（Long-term potentiation，LTP）的形成以及學習記憶功能密切相關［4-5］。研究證明，許多形式的突觸可塑性都需要ERK參與，同時動物實驗證明，抑制神經細胞中ERK活性可導致動物學習功能的降低［6］。

環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）在突觸可塑性中具有重要的作用，激活CREB可促進多種與突觸可塑性相關的轉錄因子的轉錄［7］，從而誘導產生一些與學習記憶十分相關的蛋白分子。

本實驗采用神經細胞原代培養的方法，從細胞水平觀察異氟烷對神經元ERK和CREB的影響，探討異氟烷的神經毒性以及影響學習記憶能力的潛在機制。

1　對象與方法

1.1主要材料

取24 h內新生的SPF級小鼠30只，雌雄不限，由遼寧醫學院實驗動物中心提供［動物許可證號：SYXK（遼）2009-0004］。DMEM培養基（美國Hyclone）、胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）、神經元基本培養基（美國Introvigen）、p-CREB抗體（Cell Signal公司）、p-ERK1/2抗體 （美國SANTACruz公司）、β肌動蛋白抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）、ECL發光試劑（美國Sigma公司）、Cell Titer-BlueTM Cell Viabiliy Assay試劑盒（美國Promega公司）。

1.2小鼠大腦皮層神經元分離、培養及細胞分組

設定路徑 S1={5，4，10，6，9，16，26，20，19}，路徑 S2={5，7，8，10，12，14，16，23，20，19}，為被選中父體實施雜交，S1，S2括號里的數字為路徑的節點。如去除首末節點后，相同節點有2個以上時，則將頭2個相同節點來雜交，雜交點間的節點交換，生成雜交段。從S1，S2路徑可以看出，除起始節點和結束節點相同外，相同節點為10、16和20，再選擇起始于終點實施雜交，最終得到交換后的路徑表達如下所示。

根據文獻報道［8］，選用出生24 h內的昆明小鼠，無菌條件下，斷頭處死小鼠取腦，于預冷的D-Hanks液中，分離大腦皮層后，顯微鏡下去除腦膜和血管；D-Hanks液洗2～3次，剪成小塊。37℃下0.25%胰蛋白酶消化20 min后取出吹打，用含10%胎牛血清的DMEM終止反應。4℃下1000 r/min離心5min，2次，棄上清液。DMEM調節細胞懸液濃度為5×105/mL，接種于培養瓶中，37℃恒溫的CO2培養箱內培養。半量換液，1次/2～3 d。細胞培養7 d，經神經元特異性烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）免疫細胞化學法鑒定，神經細胞占全部細胞數的90%以上，取培養7 d的神經細胞進行試驗。

培養細胞分為，對照組：常規培養；異氟烷暴露組：采用終濃度為0.96mmol/L異氟烷的培養基培養細胞，分別培養12 h及24 h，共三組。每組分別取10只動物，細胞培養每組設10個復孔。

1.3異氟烷溶液的配制

根據文獻［8］的方法，將130μL液體異氟烷加入103mL平衡鹽溶液（Balanced salt solution，BSS）中，密封后搖床上搖勻24 h，充分溶解異氟烷，配制10mmol/L儲備液。使用前迅速將30 mL溶液倒入50 mL聚丙烯離心管中，震蕩5～10 s，加入培養基（終濃度為0.96mmol/L）后用于細胞處理。

1.4MTS方法測定細胞活力

將細胞懸液稀釋至1×105/mL，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，每孔100μL。將培養板放入CO2培養箱內37℃培養過夜后，更換含有異氟烷的培養液繼續培養24 h。根據說明書，每孔加入20μLMTS試劑，37℃下孵育4 h，592 nm處測定各組細胞吸光度值A。根據公式計算生存率，細胞生存率=（A各組-A空白孔）/（A對照組-A空白孔）×100%。

1.5免疫印跡檢測神經元ERK和CREB蛋白表達

1.6 RT-qPCR檢測神經元ERK和CREB mRNA表達

Trizol法提取總RNA。SYBR GreenⅡ進行檢測，熱循環條件：95℃3 min，94℃ 15 s，60℃ 60 s，40循環。PCR擴增反應體積10μL：RNase Free dH2O23μL，SYBRRPrimeScriptTM（2×）5μL，ERK、CREB、18Sr-RNA上下游引物 （10μmol/L）1μL，DNA模板1μL，每個樣品3個復孔。采用比較Ct值（2-ΔΔCt法）相對定量法，改變的倍數（fold change）=2-ΔΔCt；ΔCt=Ct靶基因-Ct內參，ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt未處理組。以18SrRNA為內對照。以2-ΔΔCt表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數。PCR引物序列見表1。

表1　ERK、CREB、18SrRNA引物序列

1.7統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，組間計量資料比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1異氟烷對小鼠神經元生存率的影響

與對照組比較，12 h和24 h異氟烷處理組的生存率降低，生存率從對照組的100%分別降至（86.58±8.96）%和（78.63±8.23）%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　異氟烷處理不同時間后細胞生存率變化（n=10）

2.2異氟烷對小鼠神經元ERK1/2和CREB活性的影響

Western blot方法檢測小鼠神經元 ERK1/2和CREB活性，結果顯示，與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經元中p-ERK1/2和p-CREB表達水平均明顯降低 （P＜0.05）；隨著異氟烷處理時間的增加，p-ERK1/2和p-CREB表達逐漸降低，處理12 h與24 h比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2　異氟烷對小鼠神經元ERK1/2和CREB活性的影響（n=10）

2.3異氟烷對小鼠神經元ERK1/2和CREB mRNA表達的影響

RT-qPCR方法檢測了小鼠神經元ERK和CREB的mRNA表達。與對照組比較，異氟烷處理組小鼠神經元中ERK和CREB表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3　異氟烷對小鼠神經元ERK1/2和CREBm RNA表達的影響（n=10）

3　討論

全身麻醉藥目前已廣泛應用于臨床麻醉中，而其對學習記憶功能的影響也受到重視，有研究證實，吸入性麻醉藥異氟烷可以誘導產生細胞毒性，造成大鼠中樞神經系統神經元凋亡［9-10］，引起未成年小鼠大量腦神經細胞凋亡，產生術后認知功能或持續性學習功能障礙［11］。本實驗從細胞水平探討了異氟烷的神經毒性以及影響學習記憶能力的潛在機制。

本研究結果顯示：與對照組比較，0.96 mmol/L異氟烷處理后小鼠神經元活力明顯下降（P＜0.05）；磷酸化ERK1/2和CREB顯著降低（P＜0.05）。結果提示，一定濃度的異氟烷可以降低原代培養的小鼠神經元活力和ERK1/2、CREB的磷酸化水平，可能與異氟烷誘導學習記憶損傷及術后POCD相關。

ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，在神經系統中，ERK分布廣泛，參與突觸可塑性長時程增強電位誘導過程［12］，也參與神經元的凋亡，在記憶過程中發揮重要作用。研究證明，將ERK通路阻斷后，可抑制LTP的形成［13］，而影響學習記憶功能。Mawh inney等［14］發現，異氟烷可降低海馬和皮質的磷酸化ERK1/2，導致空間認知功能障礙。Liu等［15］發現，低濃度及短時間應用異氟烷可以提高pERK1/2水平，可能改善認知功能，而高濃度應用異氟烷超過4 h則會降低pERK1/2水平，而損害認知功能。本研究也發現，0.96 mmol/L的異氟烷溶液作用能對小鼠神經元產生明顯的毒性作用，且隨處理時間延長，p-ERK1/2的表達逐漸降低（P＜0.05）。

CREB是一種分子量為43 kD的核轉錄因子蛋白，參與了神經干細胞增殖、細胞周期調控、學習記憶等正常生理活動［16］。CREB上Ser-133的磷酸化位點是許多蛋白激酶的作用靶點，一旦被磷酸化，CREB介導的轉錄啟動并激發長時程增強電位相關蛋白的合成，對于神經突觸可塑性長時間改變有重要作用［17］。有結果表明在脊椎動物CREB基因被破壞后，其長時記憶形成受到影響。施小嬌等［18］發現：高濃度七氟烷可以引起大鼠麻醉后早期認知功能障礙，并呈劑量依賴性，CREB蛋白磷酸化的抑制以及記憶相關蛋白合成的減少可能是機制之一。本研究中異氟烷處理組小鼠神經元中 p-CREB表達水平均明顯降低 （P＜0.05）；并隨處理時間延長而逐漸降低（P＜0.05）。

依文獻報道［19］，0.28mmol/L異氟烷相當于臨床上1個最小肺泡濃度（Minimal alveolar concentration，MAC）的血藥濃度，一般臨床常用1.3 MAC。本研究將神經元暴露于0.96mmol/L的異氟烷濃度中，明顯高于臨床常用量，隨著處理時間的延長，神經元活力逐漸下降，與學習與記憶有關的蛋白表達受到抑制。結果提示臨床中降低用藥濃度，減少使用時間將有助于減少認知障礙及學習記憶能力下降的發生。

綜上所述，本研究結果顯示，異氟烷的神經毒性可能是由于異氟烷直接造成了神經細胞活力的下降，同時也顯著抑制了神經元內學習記憶相關的重要蛋白ERK和CREB的活性。這些現象可能與異氟烷引發圍術期成年患者術后POCD相關。可能機制包括線粒體功能障礙、氧化應激、抑制海馬神經元腦源性神經營養因子前體的水解，促進神經元凋亡等［20］。還需要更多的工作來深入研究異氟烷與ERK/CREB通路間復雜的相互作用，以明確異氟烷在神經損傷中的確切作用。

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Effect of Isoflurane exposure on expressions of ERKs and CREB in neuron of newborn mice

ZHANG Bin
Department of Anesthesiology，Jinzhou Central Hospital，Liaoning Province，Jinzhou121001，China

R614.2

A

1673-7210（2016）09（b）-0022-04

2016-06-10本文編輯：任念）

張斌（1977.10-），男，副主任醫師；研究方向：神經阻滯、體外循環。