荷葉黃酮抗氧化能力的研究

吳海霞

摘 要：該文對(duì)荷葉黃酮抗氧化能力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，將荷葉的抗氧化能力與已知的常用抗氧化劑維生素C和蘆丁作為對(duì)照進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，荷葉的乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可以有效的清除DPPH·自由基、·OH自由基、抑制油脂自動(dòng)過(guò)氧化和抑制Fe2+誘發(fā)脂蛋白過(guò)氧化；隨著荷葉提取物用量的增加，其抗氧化能力也隨之增加。為實(shí)現(xiàn)荷葉更好的開發(fā)與利用，此文提供一定的研究參考。

關(guān)鍵詞：荷葉；黃酮；抗氧化能力；研究

中圖分類號(hào) TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）16-0015-03

Abstract：Determination of antioxidant capacity of lotus leaf.Based on the observations above，the antioxidative capacity of the lotus leaf extract with several promulgated antioxidant were further compared，such as vitamin C and rutin.The results showed that the lotus leaf extract had better antioxidative capacity，which could effectively clear DPPH·free radical and ·OH free radical. The lotus leaf extract could inhibit the lipid auto-peroxidization and Fe2+-induced lipoprotein peroxidation were also validated.The antioxidative capacity of the lotus leaf extrac was enhanced with the increment of the amount of extract. In order to achieve better development and utilization of the lotus leaf，this paper provides a certain value of research.

Key words：Lotus leaf；Total flavonoids；Antioxidant activity；Research

荷葉是睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera）的葉片，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為：荷葉苦、平，具有清暑利濕，抑菌、清心去熱，涼血、止血的作用[1]。研究表明，荷葉含有豐富的碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)、單寧等普通化學(xué)成分外，還富含具有明顯的生物活性和生理功能的黃酮類化合物等物質(zhì)。近幾年，研究報(bào)道有關(guān)荷葉及荷葉提取物藥理作用的較多[2-5]，但對(duì)荷葉的乙醇提取物生物活性功能的綜合研究比較少見。本試驗(yàn)進(jìn)一步探索荷葉黃酮提取物的抗氧化活性，以期為荷葉的相關(guān)保健食品、藥品、和食品防腐劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

為了更好地表明荷葉具有較強(qiáng)的抗氧化能力，本實(shí)驗(yàn)采用維生素C（抗壞血酸）、天然抗氧化劑蘆丁（一種黃酮類化合物）和丁基羥基茴香醚（BHA）等作為參照試驗(yàn)進(jìn)行比較。維生素C和蘆丁都是已知的被廣泛使用的抗氧化劑，維生素C、BHA和蘆丁在清除自由基、超氧陰離子和過(guò)氧化氫、提高抗氧化酶的活性、阻斷自由基所引起的氧化反應(yīng)、防止體內(nèi)自由基代謝紊亂等方面具有重要的生理活性作用[6]。因此，選用維生素C、BHA和蘆丁作為參照試驗(yàn)，可以很好的表明荷葉的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 荷葉（購(gòu)買于中藥藥店），豆油、新鮮雞蛋（購(gòu)買于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）

1.1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、FA1104電子天平（上海天平儀器廠）、超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）、Spectrumlab 755s紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）、調(diào)解式萬(wàn)用電爐（南通長(zhǎng)江光學(xué)儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴箱（國(guó)華電器有限公司）、離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.1.3 試劑 無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、DPPH·（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）（Sigma公司）、Rutin trihydrate（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、三氯乙酸（TCA）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、碘化鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、硫代巴比妥酸（TBA）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、水楊酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、雙氧水（上海金鹿化工有限公司）、硫代硫酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、硫酸亞鐵（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、丁基羥基茴香醚（BHA）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 原料干品粉碎后，分別稱取2g，放入l00mL錐形瓶中，按照一定的料液（g/mL），加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（%），在一定的溫度（℃）下，超聲提取一定時(shí)間。提取結(jié)束后，抽濾，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將粗提液中的乙醇揮發(fā)干凈，加蒸饋水定容至250mL，搖勻，備用。

1.2.2 清除羥自由基能力的測(cè)定 采用Fenton法產(chǎn)生·OH，以水楊酸作為羥基自由基的捕捉劑，通過(guò)測(cè)定水楊酸捕捉·OH的產(chǎn)物來(lái)確定各樣品對(duì)·OH的清除率[7-8]。向試管中分別依次加入不同濃度的蘆丁和荷葉提取物樣品溶液5mL，10mmol/mL水楊酸溶液1mL，pH=7.4的磷酸緩沖液3mL，2.8mmol/mL FeSO4溶液2.00mL，最后加入3%的H2O2溶液5mL，充分振蕩混勻，在水浴35℃條件下保溫40min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定分別測(cè)定吸光值（測(cè)定時(shí)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值），計(jì)算羥自由基消除率：

羥自由基清除率（%）=[A0-（Am-An）]/A0×100

式中：A0為空白管的吸光值；Am為樣品管的吸光值；An為樣品自身的吸光值。

1.2.3 清除DPPH·自由基能力的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取DPPH 0.0112g，用95%乙醇定容于50mL容量瓶中。用微量移液器分別取不同濃度的蘆丁、維生素C和荷葉提取物樣品溶液和DPPH溶液各2mL于試管中，搖勻后放置40min后在517nm處側(cè)得吸光度A，按照下列公式計(jì)算各不同濃度的樣品對(duì)DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率（%）=[A0-（A-A2）]/A0×100

式中：A0為對(duì)照吸光度值（僅含DPPH乙醇溶液）；A2為空白對(duì)照的吸光度值（樣品與無(wú)水乙醇用以消除樣品本身顏色的影響）。

1.2.4 防止油脂氧化的能力測(cè)定 油脂在自然放置的條件下會(huì)發(fā)生自動(dòng)氧化，造成油脂的酸敗，通過(guò)測(cè)定油脂的過(guò)氧化值（POV值）可以確定油脂氧化的程度[9]。準(zhǔn)確稱取30g油脂，分別加入不同濃度的樣品溶液5mL于燒杯中，放置于68℃烘箱中進(jìn)行保存，每隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果來(lái)表示油脂的酸敗程度，進(jìn)而評(píng)價(jià)各個(gè)樣品的抗氧化活性能力。油脂POV值的測(cè)定方法如下：

稱取豆油混樣3～4g，若有沉淀物需要進(jìn)行過(guò)濾，加入到250mL具塞三角瓶中，然后加入20mL比例為2∶3的三氯甲烷-冰乙酸混合液，充分振搖。當(dāng)樣品全部溶解后，加入1.00mL飽和KI溶液，輕輕振搖35s，置于暗處3min。然后加85mL蒸餾水稀釋搖勻，立即用0.01mol/L的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，至溶液顏色變?yōu)榈S色時(shí)，滴加1mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失。同時(shí)要做不加試樣的空白對(duì)照試驗(yàn)。樣品的過(guò)氧化值計(jì)算如下：

POV=C×（V1-V2）/m×1000

式中：C為硫代硫酸鈉的濃度，mol/L；V1為樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白組消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 抑制Fe2+誘發(fā)脂蛋白過(guò)氧化能力的測(cè)定 分別將荷葉黃酮和維生素C配制成不同濃度的樣品溶液，對(duì)其抑制Fe2+誘發(fā)脂蛋白過(guò)氧化的能力進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法如下[10]：

蛋黃稀釋液的配制：小心將雞蛋去殼，取出蛋黃備用，加入相同體積的0.1mol/L，pH為7.54的PBS溶液，配成蛋黃懸浮液。使用時(shí)要用磁力攪拌器攪10min后，并稀釋25倍得到蛋黃稀釋液。

分別向試管中加入0.4mL蛋黃稀釋液，不同濃度的荷葉黃酮稀釋液和維生素C溶液60μL，25mmol/L的硫酸亞鐵溶液0.2mL，然后用0.1mol/L的PBS補(bǔ)足到2mL。對(duì)照組不加荷葉提取物溶液，其他相同。調(diào)零管與對(duì)照組一樣，不同的是先加入0.5mL 20%三氯乙酸，在用PBS補(bǔ)足道2mL。在37℃條件下，水浴15min后，除了調(diào)零管不加三氯乙酸外，其他試管均要加入0.5mL 20%的三氯乙酸來(lái)終止反應(yīng)。置4 000r/min離心機(jī)，離心8min，取上清液2.0mL，添加0.8%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0mL，封口100℃水浴15min，取出快速冷卻，在532nm處測(cè)定其吸光值，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值。試驗(yàn)樣品的抗脂蛋白過(guò)氧化活性（AOA）的抑制率按以下公式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 荷葉黃酮對(duì)羥自由基清除能力 由圖1可知，荷葉黃酮對(duì)·OH具有一定的清除能力，而且在荷葉黃酮的用量為90～110μg時(shí)，其對(duì)羥自由基的清除能力比10～30μg的蘆丁清除率要高。

2.2 荷葉黃酮對(duì)DPPH·清除能力 由圖2可知，荷葉黃酮清除DPPH·的能力比較強(qiáng)。通過(guò)計(jì)算，這3種樣品對(duì)DPPH·清除率達(dá)到50%的清除劑量分別為：荷葉提取物為12.45μg，蘆丁為17.23，維生素C為12.13。由此可以得，荷葉提取物清除DPPH·的能力與維生素C相當(dāng)，但是要比蘆丁的清除能力強(qiáng)。這樣就表明荷葉提取物可以作為開發(fā)研究的材料來(lái)提取出有效的活性抗氧化成分。

2.3 荷葉黃酮抑制豆油氧化能力 由圖3可以得出，將不同劑量的荷葉黃酮和BHA加入到豆油中，其過(guò)氧化值（POV）都要比對(duì)照組低，這就表明荷葉黃酮能夠有效的抑制豆油在自然條件下的自動(dòng)氧化，能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。但是相對(duì)于BHA來(lái)說(shuō)，其抗氧化能力稍微有點(diǎn)不足，可能是因?yàn)楹扇~黃酮的有效活性成分不純，導(dǎo)致效果沒(méi)有BHA好。如果對(duì)提取物進(jìn)一步提純，其抗氧化效果可能會(huì)更有效。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)采用對(duì)荷葉黃酮進(jìn)行體外的抗氧化活性研究，并和已知的常用抗氧化劑維生素C和蘆丁進(jìn)行對(duì)照，說(shuō)明荷葉提取物具有一定的抗氧化能力，并且隨著用量的增大，其表現(xiàn)出較好的抗氧化效果，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

以·OH自由基清除法、DPPH·自由基清除法、抑制油脂過(guò)氧化能力法和抑制Fe2+誘發(fā)脂蛋白過(guò)氧化能力法分別探究荷葉黃酮的抗氧化效果發(fā)現(xiàn)：荷葉提取物對(duì)·OH自由基和DPPH·自由基均具有較強(qiáng)的抗氧化效果，表明荷葉提取物具有較強(qiáng)的還原能力和清除自由基的能力。荷葉取物對(duì)抑制脂質(zhì)的自動(dòng)氧化和抑制Fe2+誘發(fā)脂蛋白過(guò)氧化也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。而且隨著荷葉黃酮用量的增加，其抗氧化活性也隨之增強(qiáng)。

通過(guò)將荷葉黃酮與日常使用的強(qiáng)抗氧化劑維生素C、BHA和蘆丁進(jìn)行對(duì)照比較，表明荷葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化效果和清除自由基的能力。目前，市場(chǎng)上銷售的大部分為人工合成的抗氧化劑，其使用過(guò)多會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害，而荷葉黃酮中的抗氧化活性成分主要為黃酮類化合物，是一種天然的有效的抗氧化劑。因此，將荷葉黃酮應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、抗氧化劑等研發(fā)領(lǐng)域中具有廣闊的前景。

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（責(zé)編：張長(zhǎng)青）