左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖培養小鼠足細胞凋亡的影響

陳聰，羅文娟，喻嶸*，劉慧萍，楊勝輝，唐元，曾婧，張翔

（1.貴陽中醫學院，貴州貴陽550000；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

·方藥研究·

左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖培養小鼠足細胞凋亡的影響

陳聰1，羅文娟2，喻嶸2*，劉慧萍2，楊勝輝2，唐元2，曾婧2，張翔2

（1.貴陽中醫學院，貴州貴陽550000；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

目的探討在高糖作用下，體外培養的小鼠足細胞凋亡及bax、bcl-2表達水平的變化，及左歸降糖益腎方含藥血漿的調控作用。方法將體外培養的小鼠足細胞隨機分為空白組（A組，25 mmoL/L葡萄糖，10%空白血漿）、高糖組（B組，200 mmoL/L葡萄糖，10%空白血漿）、左歸降糖益腎方含藥血漿組（C組，200 mmoL/L葡萄糖，10%含藥血漿），4-苯基丁酸（4-PBA）含藥血漿組（D組，200 mmoL/L葡萄糖，10%含藥血漿）。采用間接免疫熒光細胞化學法檢測足細胞凋亡情況；MTT自動比色法檢測足細胞活力，蛋白質印跡法和逆轉錄-聚合酶鏈反應法分別檢測bax及bcl-2蛋白或mRNA表達水平的變化。結果與A組相比，B組足細胞活力降低，bax及bcl-2蛋白或mRNA的表達水平均升高（P＜0.01）；與B組相比，C組、D組足細胞活力升高，bax蛋白或mRNA的表達水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），bcl-2蛋白或mRNA的表達水平均升高（P＜0.01）；與C組比，D組足細胞活力升高（P＜0.05），但bax及bcl-2蛋白或mRNA的表達水平，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論bax及bcl-2蛋白或mRNA表達水平的升高，是足細胞損傷的分子機制之一；左歸降糖益腎方含藥血漿可以通過影響bax及bcl-2蛋白或mRNA的表達水平，從而抑制足細胞凋亡。

左歸降糖益腎方；高糖；足細胞；bax；bcl-2

〔Abstract〕Objective To investigate the expression levels of bax，bcl-2 and cell apoptosis in podocyte cells cultured in high glucose condition in vitro，and the regulation effects of Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma.M ethods Cultured podocyte cells of mouses were divided into four groups：blank group（group A，25 mmoL/L glucose，10%blank plasma），high glucose group（group B，200 mmoL/L glucose，10%blank plasma），Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma group（Group C，200 mmoL/L glucose，10%containing medicine plasma），and 4-Phenylbutyric acid（4-PBA）group（group D，200 mmoL/L glucose，10%containing medicine plasma）.The cell apoptosis were observed by immunofluorescence stainings.The cell viability was detected by MTT colorimetry assay.The protein and mRNA expressions of bax and bcl-2 were analyzed by Western blot or reverse transcription-polymerase chain reaction，respectively.Results Compared withthe group A，the viability of podocyte cells was significantly decreased of group B，and their expressions of bax and bcl-2 protein or mRNA were upregulated（P＜0.01）.Compared with group B，the expressions of bax protein or mRNA of podocyte cells were downregulated（P＜0.05 or P＜0.01），but the protein or mRNA of bcl-2 were upregulated（P＜0.01）.Compared with group C，the cell viability of group D was significantly upcreased（P＜0.05），but there was no statistical significance of their expressions of bax and bcl-2 protein or mRNA（P＞0.05）.Conclusion The higher level expressions of bax and bcl-2 protein or mRNA were the molecular mechanisms of podocyte injury.ZJYD plasma can repair the damaged podocyte by regulateing the protein or mRNA expressions of bax and bcl-2.

〔Keywords〕Zuogui Jiangtang Yishen decoction；high glucose；podocyte；bax；bcl-2

足細胞位于腎小球基底膜外側，是終末分化的上皮細胞，幾乎沒有再生能力，是腎小球濾過的最后一道屏障。足細胞的損傷和剝脫，與糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）早期發病相關［1-3］。細胞凋亡是導致足細胞損傷和丟失的重要原因之一。bax、bcl-2是調節細胞凋亡的關鍵蛋白質，其動態平衡維持著細胞的存活［4-5］。

課題組前期研究發現左歸降糖益腎方可改善糖尿病腎病MKR鼠腎功能，保護足細胞結構［6］。在前期研究基礎上，本文進一步探討左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖誘導足細胞凋亡及bax、bcl-2表達的影響，為糖尿病腎病的靶向治療提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及動物小鼠足細胞購自北京協和細胞中心（mouse podocyte；3111C0001CCC000230）。培養及傳代方法參見文獻［7］。實驗場地主要由湖南中醫藥大學醫學基礎教學實驗中心提供。8周齡SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2011-0003，體質量約220 g，飼養于湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心。

1.1.2主要試劑總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒，購自Fermentas公司；PCR引物，由上海生工公司合成；RIPA裂解液，購自北京百泰克生物技術有限公司；Mouse GAPDH antibody購自SANTA公司；兔抗小鼠bax、bcl-2多克隆抗體，辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗，均購自上海碧云天生物技術有限公司；Hoechst 33258熒光染料，購自合肥博美生物科技有限責任公司；葡萄糖（分析純），購自上海國藥集團化學試劑有限公司；4-苯基丁酸（4-PBA）購自Sigma公司。

1.1.3主要儀器TG16W型臺式離心機，購自長沙平凡儀器儀表有限公司；WD-9402 A型PCR擴增儀，購自北京六一儀器廠；F1-F2 Fuses Type T2A型化學發光凝膠成像分析系統，購自Bio-Rad公司；BioPhotometer plus型核酸蛋白分析儀，購自Eppendorf公司；A1型激光共聚焦顯微鏡，購自尼康公司。

1.1.4含藥血漿制備左歸降糖益腎方由熟地黃、黃芪、山藥等9味藥組成（中藥湯劑制備：飲片經水浸泡30 min后，經水煎煮2次，混合濾過后的濾液，濃縮成含生藥濃度為2 g/mL的藥液，滅菌后置4℃冰箱中保存備用）。SD大鼠24只，隨機分為3組：空白組、全方組、4-PBA組，每組8只。按臨床常用劑量的3倍給藥，給藥劑量按人與大鼠體表面積換算法計算。全方組藥物濃度為2 g/mL，給藥量29.21 g/kg，灌胃容量14.6 mL/kg；4-PBA組藥物濃度0.2 g/mL，給藥量3 g/kg，灌胃容量15 mL/kg；采用連續7 d灌胃給藥，每天1次。空白組予等量蒸餾水灌胃，體積同全方組。末次給藥1 h后，腹主動脈插管取血，7.5%EDTA·Na2抗凝，收集血漿，0.22μm濾膜濾過，56℃水浴滅活30 min，分裝，放置于-20℃冰箱備用。臨用時，均采用不含FBS的DMEM培養液配制至所需濃度用于實驗［7］。

1.2方法

1.2.1細胞培養、分組及給藥小鼠足細胞以含10%胎牛血清，90%DMEM完全培養基（含100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、25 mmol/L葡萄糖）在細胞培養室5%CO2，37℃培養箱中培養。期間2～3 d更換培養液一次，倒置顯微鏡觀察細胞形態，待細胞體積明顯增大，向四周伸出足突分化成熟后用于實驗。

用完全培養基調細胞密度為1×105/mL的細胞懸液，然后轉種培養瓶中，加入完全培養基總體積5 mL，放入CO2培養箱中培養至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM培養液同步化處理12 h后，分為空白組（A組，10%空白血漿的DMEM培養基，終濃度25 mmol/L葡萄糖），高糖組（B組，含10%空白血漿的DMEM培養基，終濃度200 mmol/L葡萄糖），左歸降糖益腎方含藥血漿組（C組，10%含藥血漿的DMEM培養基，終濃度200 mmol/L葡萄糖），4-PBA含藥血漿組（D組，10%含藥血漿的DMEM培養基，終濃度200 mmol/L葡萄糖）。根據課題組預實驗結果，選擇在48 h后收集細胞。用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細胞，加入完全培養基終止消化，離心管收集細胞懸液，1000 r/pm，5 min離心，棄上清；用PBS洗滌細胞沉淀2～3次，1000 r/pm，5 min離心，棄上清；置冰上，用于逆轉錄-聚合酶鏈反應、蛋白質印跡法等相關檢測。

1.2.2MTT比色法將細胞懸液接種于96孔培養板，每孔約10000個，每組各5復孔，貼壁后，分別加入相應培養基，孵育48 h后，終止反應，吸除多余培養液，PBS洗2次后，每孔加入含MTT（0.5 mg/mL）的DMEM培養液（不含胎牛血清）150μL，37℃繼續孵育4 h后，終止培養，吸棄廢液，不洗，每孔加入100μL DMSO，避光置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上570 nm波長檢測各孔吸光值。

1.2.3間接免疫熒光細胞化學法在無菌狀態下，將防脫蓋玻片分別放入6孔培養板中。每孔均勻加入含細胞1×105/mL的完全培養基懸液1 mL，放入CO2培養箱中培養至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM培養基同步化處理12 h后，分為A組、B組、C組、D組。分別加入相應培養基，48 h后收集細胞，用PBS洗滌5 min，3次，加入4%多聚甲醛固定（25～30 min），PBS洗滌5～10 min，3次。用1%曲拉通X-100（PBS配制）打孔，2～5 min，PBS洗3次，每次5～10 min。Hoechst 33258染核（1∶400，PBS稀釋），室溫，15 min，PBS洗3次，每次10 min，等水晾干，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下拍片［7］。

1.2.4蛋白質印跡法按試劑盒操作提取總蛋白，蛋白樣品100℃變性10 min后，用50μg蛋白樣品電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結束后轉膜90 min，將轉有蛋白的膜置于5%脫脂奶粉中封閉（用TBST稀釋奶粉），4℃過夜，不洗，置于兔抗小鼠多克隆一抗，按試劑盒說明書，TBST稀釋，孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗，按試劑盒說明書，TBST稀釋，室溫孵育1～2 h，TBST洗3次，每次10 min。加入ECL化學發光試劑，Bio-Rad化學發光凝膠成像分析系統以目的條帶灰度值與同個樣品的GAPDH（按試劑盒說明書，TBST稀釋）灰度值的比值表示目的基因蛋白表達水平［8］。

1.2.5逆轉錄-聚合酶鏈反應用總RNA提取試劑盒抽提其總RNA，采用核酸蛋白分析儀測定其濃度。取1μg總RNA，隨后用逆轉錄試劑盒以Oligo（dT）為引物進行逆轉錄反應。以GAPDH為內參基因。應用Primer 5.0軟件，根據GenBank中小鼠的序列設計引物。bax：上游5’-CCAGGATGCGTCCACCAAGAA-3’下游5’-CAAAGTAGAAGAGGGCAAC CAC-3’，產物大小197 bp。bcl-2：上游5’-GGTAC CGGAGAGCGTTCAGT-3’下游5’-CTGCTGCATTG TTCCCGTAG-3’，產物大小303bp。GAPDH，上游5’-GCTCACTTGAAGGGTGG-3’，下游5’-CCATTCGTT GTCGTACCA-3’，產物大小500 bp。

選擇最適條件分別對目的基因和GAPDH進行PCR擴增，PCR產物選擇瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad化學發光凝膠成像分析系統分析電泳條帶灰度值，以目的基因和GAPDH電泳條帶灰度值比值計算mRNA相對表達量。

1.2.6統計學處理使用SPSS 19.0統計軟件處理，結果以“±s”表示。數據滿足正態性及方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗；若不滿足，則采用非參數檢驗，P＜0.05示差異有統計學意義。

2　結果

2.1足細胞活力檢測結果

與A組相比，B組足細胞活力降低；與B組相比，C組、D組足細胞活力升高；與C組比，D組足細胞活力升高；差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

2.2足細胞細胞核凋亡檢測結果

A組細胞核呈較均勻的藍色熒光，核仁較清晰；B組凋亡細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。C組與D組細胞核凋亡情況較B組改善。見圖1。

表1　各組足細胞活力的比較（±s，n=5）

表1　各組足細胞活力的比較（±s，n=5）

注：與A組比，**P＜0.01；與B組比，##P＜0.01；與C組比，★P＜0.05。

組別A B C D OD值0.77±0.01 0.46±0.03** 0.61±0.01**##0.67±0.01**##★

圖1　足細胞凋亡檢測激光共聚焦顯微鏡圖（×600）

2.3足細胞bax及bcl-2蛋白檢測結果

與A組相比，B組bax及bcl-2蛋白表達水平均升高（P＜0.01）；與B組相比，C組、D組bax蛋白表達水平均降低（P＜0.01），bcl-2蛋白表達水平均升高（P＜0.01）；與C組比，D組bax及bcl-2蛋白的表達水平，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2　各組足細胞bax及bcl-2蛋白表達水平的比較（±s，n=5）

表2　各組足細胞bax及bcl-2蛋白表達水平的比較（±s，n=5）

注：與A組比，▲▲P＜0.01；與B組比，◆◆P＜0.01。

組別A B C D bax/GAPDH 0.41±0.03 1.09±0.03▲▲0.97±0.03▲▲◆◆0.99±0.01▲▲◆◆bcl-2/GAPDH 0.46±0.03 0.65±0.02▲▲0.84±0.02▲▲◆◆0.86±0.01▲▲◆◆bax/bcl-2 0.90±0.02 1.68±0.02▲▲1.15±0.02▲▲◆◆1.16±0.01▲▲◆◆

2.4足細胞bax及bcl-2的mRNA檢測結果

與A組相比，B組bax及bcl-2 mRNA表達水平均升高（P＜0.01）；與B組相比，C組、D組bax mRNA表達水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），bcl-2 mRNA表達水平均升高（P＜0.01）；與C組比，D組bax及bcl-2的mRNA表達水平，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3　各組足細胞bax及bcl-2mRNA表達水平的比較（±s，n=5）

表3　各組足細胞bax及bcl-2mRNA表達水平的比較（±s，n=5）

注：與A組比，▲▲P＜0.01；與B組比，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

組別A B C D bax/GAPDH 0.65±0.06 1.26±0.03▲▲1.17±0.04▲▲◆◆1.19±0.03▲▲◆bcl-2/GAPDH 0.63±0.04 0.84±0.02▲▲0.94±0.02▲▲◆◆0.97±0.03▲▲◆◆bax/bcl-2 1.04±0.06 1.49±0.02▲▲1.25±0.03▲▲◆◆1.23±0.02▲▲◆◆

圖2　各組bax、bcl-2的mRNA及蛋白的表達電泳圖

3　討論

DN的發生發展機制復雜，目前研究認為DN是多種危險因素作用于不同環節所導致的慢性疾病。足細胞受損、凋亡致其數目的減少是導致DN蛋白尿發生的關鍵因素，也是導致腎小球硬化的重要因素之一［9-10］。當足細胞數量和密度減少時，殘存的足細胞為覆蓋裸露的腎小球基底膜（GBM）而出現代償性肥大、足突增寬、融合，從而使腎小球濾過屏障的通透性增加，導致蛋白尿的發生。過多丟失足細胞還會導致GBM外露，失去了足細胞支撐的GBM會在毛細血管靜水壓的作用下突向腎小囊，進而與腎小球壁層上皮細胞黏連，從而形成腎小球硬化。因而，抑制足細胞凋亡具有重要意義。

bcl-2和bax是目前公認的一對調節細胞凋亡的關鍵基因。bcl-2是Tsujimoto等人于1984年首次在研究濾泡性非霍奇金B細胞淋巴瘤中分離出來的一種原癌基因，根據其家族成員功能和結構的不同可分為兩大類，即抑制凋亡的家族成員（包括bcl-2、bcl-xl等）和促凋亡家族成員（包括bax、bclxs、bak等）。bcl-2、bax二者主要通過同源或者異源二聚體的形成來完成對細胞凋亡的調節。當bax形成同源二聚體時則發揮其誘導細胞凋亡的作用，而當bax與bcl-2形成異源二聚體時則發揮對細胞凋亡的抑制作用。有研究發現，bcl-2與bax之間的動態平衡決定著細胞的存亡［11］，主要以bax/bcl-2的比率來表示。桂定坤等［12］通過實驗研究表明bax/bcl-2動態失衡是引起足細胞凋亡的重要原因，而因bcl-2表達下降所致足細胞凋亡，則是加速腎小球硬化、加重腎損傷的關鍵。

課題組前期研究選擇高糖濃度200 mmol/L作為實驗濃度。本實驗通過高糖200 mmol/L誘導足細胞凋亡，48 h后收集細胞，通過對足細胞凋亡因子bcl-2、bax的mRNA和蛋白的檢測，發現在足細胞損傷模型組中，與空白組相比，bax、bcl-2及bax/ bcl-2的表達升高（P＜0.01），提示bcl-2、bax、bax/ bcl-2在調控足細胞凋亡方面起著重要的作用。同時與模型組比較，左歸降糖益腎方含藥血漿組bax和bax/bcl-2比值的表達下調，而抑制凋亡的bcl-2 mRNA和蛋白的表達上調；足細胞活力升高；激光共聚焦顯微鏡圖顯示足細胞細胞核凋亡狀況明顯改善。提示左歸降糖益腎方含藥血漿可通過調節bax/ bcl-2比值從而調控足細胞凋亡。

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（本文編輯楊瑛）

Effects of Zuogui Jiangtang Yishen Decoction Plasma on Apoptosis of Podocyte Cells Cultured in High G lucose Condition

CHEN Cong1，LUO Wenjuan2，YU Rong2*，LIU Huiping2，YANG Shenghui2，TANG Yuan2，ZENG Jing2，ZHANG Xiang2
（1 Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550000，China；2.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R256.5；Q71；R587.1

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.002

2016-02-19

國家自然科學基金面上項目（81273753）；湖南省自然科學基金（12JJ2048，12JJ9031）；湖南省高校創新平臺開放基金（14K069）；細胞生物學與分子技術湖南高校重點實驗室；“心腦疾病中西醫結合防治研究”湖南省高校科技創新團隊資助；貴陽中醫學院2015年院內博士啟動基金資助。

陳聰，女，碩士，研究方向：內分泌疾病的中醫辨證規律及其防治研究。

〔通迅作者〕*喻嶸，女，教授，博士研究生導師，E-mail：yuron@21cn.com。