靈仙通絡方對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原及基質金屬蛋白酶-13表達的影響

林強，祁文兵，白明華，王明懷，于繼崗，彭頁

（1.陜西省寶雞市中醫醫院，陜西寶雞721000；2.人民解放軍空軍總醫院，北京100142）

靈仙通絡方對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原及基質金屬蛋白酶-13表達的影響

林強1，祁文兵1，白明華1，王明懷1，于繼崗1，彭頁2

（1.陜西省寶雞市中醫醫院，陜西寶雞721000；2.人民解放軍空軍總醫院，北京100142）

目的探討靈仙通絡方對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原（COL-Ⅱ）及基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）的影響。方法選取C518大鼠膝關節軟骨細胞株，隨機分為中藥組（靈仙通絡方）、西藥組（氨糖美辛）和對照組（氯化鈉溶液），進行培養、誘導退變等處理，于給藥后第1、2、3 d，分別檢測中藥組、西藥組和對照組不同濃度下對軟骨細胞增殖、COL-Ⅱ及MMP-13表達的影響。結果同一時間點的中藥組、西藥組不同濃度之間噻唑藍（MTT）值差異有統計學意義（P＜0.01）。對照組不同濃度氯化鈉溶液的MTT值差異不具有統計學意義（P＞0.05）。在COL-Ⅱ免疫組化染色中，中藥組與西藥組和對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01），且中藥組優于西藥組（染色指數χ2=16.26，df=2，P＜0.01）。在MMP-13免疫組化染色中，對照組較中藥組、西藥組差異有統計學意義（P＜0.01），且中藥組優于西藥組（染色指數χ2=54.31，df=2，P＜0.01）。結論C518大鼠膝關節退變軟骨細胞經靈仙通絡方干預后能夠促進其增殖，調節COL-Ⅱ、MMP-13的表達，延緩膝關節骨性關節炎疾病的發展進程。

膝關節退變；軟骨細胞；Ⅱ型膠原；基質金屬蛋白酶-13；軟骨細胞增殖；靈仙通絡方

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of Lingxian Tongluo prescription on the expression of cartilage cell，COL-II and MMP-13 in C518 rats with knee joint degeneration.Methods Selected C518 rat knee cartilage cell line as the object，which were random ly divided into the Chinese medicine group（Lingxian Tongluo decoction）and Western medicine group（indometacin and glucosamine）and control group（sodium chloride solution），and then the above groups were treated with culture and induced degeneration.On the 1st d，2nd d，3rd d after administration，and then the expression of cartilage cell，COL-II and matrixmetalloproteinase-13（MMP-13）in rats with knee joint degeneration was detected.Results At the same time point，the MTT values of the Traditional Chinese medicine group and Western medicine group had significant difference（P＜0.01）.The MTT values of the control group were not statistically significant（P＞0.05）.Compared with the Western medicine group and the control group，the COL-II immunohistochemical staining of Traditional Chinese medicine group were statistically significant（P＜0.01），and the Traditional Chinese medicine group was better than the Western medicine group（dyeing indexχ2=16.26，df=2，P＜0.01）.The MMP-13 immunohistochemistry staining in the control group was significant comparing with the Traditional Chinese medicine group and the Western medicine group，with statistical significance（P＜0.05），and the Western medicine group compared with the Traditional Chinese medicine group was significantly different（P＜0.05），and the traditional Chinese medicine group was better than that of the Western medicine group（dyeing indexχ2=54.31，df=2，P＜0.05）.Conclusion The knee degenerative cartilage cells of C518rats intervened by Lingxian Tongluo prescription can promote its proliferation，regulate the expression of COL-II and MMP-13，and delay the development of knee osteoarthritis disease.

〔Keywords〕knee joint degeneration；cartilage cells；collagen TypeⅡ；matrixmetalloproteinase-13；cartilage cell proliferation；Xianling Tongluo prescription

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床常見的嚴重骨關節疾?。?］，多發于中老年，然而其發病機制尚不明確。目前，臨床用于治療KOA的方法有很多種，大部分與細胞因子的合成及分解代謝有關［2］，價格昂貴，不良反應較多，不適合患者長期應用。中醫藥在治療KOA方面具有價廉、安全性高的優勢［3］，深受廣大患者青睞。為此，筆者采用靈仙通絡方對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞進行干預，觀察其對軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原（COL-Ⅱ）及基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）表達的影響，為臨床治療KOA提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品靈仙通絡方（方藥組成：威靈仙、白芍、防己、黃芪、延胡索、全蝎、蜈蚣，由我院藥房提供），上述諸藥加水煎煮、抽濾、蒸發濃縮成水煎劑（相當于生藥1.90 g/mL）。氨糖美辛腸溶片由廣東逸舒制藥有限公司提供，批準文號為國藥準字H44022796。1.1.2試劑H2O2由蘇州市博洋化學品有限公司提供，DMEM培養基由上海鈺博生物科技有限公司提供，青-鏈霉素由上?；馍锛夹g有限公司提供，FBS由上海喬羽生物科技有限公司提供，0.25%胰蛋白酶由上海研謹生物科技有限公司提供，噻唑藍（MTT）由上海豐壽實業有限公司提供，二甲基亞砜（DMSO）由上海喬羽生物科技有限公司提供。COL-Ⅱ、MMP-13的Ⅰ抗以及Ⅱ抗均購自上海基免生物技術有限公司。

恒溫水浴箱由江蘇省金壇市環宇科學儀器廠提供，HSX-150細胞培養箱由上海和呈儀器制造有限公司提供，多功能生化酶標儀由上海益聯醫學儀器發展有限公司提供，ST16R臺式高速冷凍離心機Thermo由北京聯合科力科技有限公司提供，奧林巴斯CKX41倒置顯微鏡由上海澤途機電設備有限公司提供。

1.2實驗動物

C518大鼠膝關節軟骨細胞株由中國藥科大學生命科學院提供。wistar大鼠，15只，體質量為（180± 20）g由山東魯抗醫藥有限公司提供，生產許可證號：SCXK（魯）20130001。

1.3分組、給藥及含藥血清制備

將上述大鼠隨機分為中藥組（靈仙通絡方組）、西藥組（氨糖美辛）和對照組（氯化鈉溶液），每組5只。中藥組大鼠給予靈仙通絡方水煎液（200 mg/kg，生理鹽水配置），灌胃給藥；西藥組給予氨糖美辛（200 mg/kg，生理鹽水配置），給藥途徑同靈仙通絡組，對照組僅給予同體積的氯化鈉溶液（蒸餾水配置）。連續給藥3天后，將所有大鼠麻醉，舌下靜脈取血，離心，取上層血清，高溫滅活，低溫保存備用。

1.4MTT實驗

1.4.1細胞培養在C518大鼠膝關節軟骨細胞株加入含有1%青-鏈霉素和10%FBS的DMEM培養基中培養。培養過程中，3 d更換1次培養液，當瓶底被細胞鋪滿時，進行傳代。

1.4.2誘導細胞退變上述細胞培養6 h后，用含有300μL H2O2的DMEM培養基培養4 d，觀察顯微鏡下細胞形態，確認誘導細胞退變成功。

1.4.3MTT操作步驟將誘導退變成功的細胞以每孔1.0×105cell/mL細胞種植于3個96孔培養板中，繼續用無血清培養基培養24 h，分為3組：靈仙通絡方組［含藥血清（2.5%、5%和10%）的培養基］、氨糖美辛組［含藥血清（2.5%、5%和10%）的培養基］、氯化鈉溶液組［含氯化鈉血清（2.5%、5%和10%）的培養基］，每組中每個濃度培養4孔，每組12孔，1個96孔板培養36個孔，繼續培養，分別在給藥第1 d、2 d和3 d后，分別每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續培養4 h。終止培養，吸去培養液，每孔加入150μL DMSO，低速振蕩10 min，充分溶解。采用多功能生化酶標儀波長為490 nm處測量各孔的吸光度。

1.5免疫組化檢測

1.5.1免疫組化染色將上述誘導退變成功的軟骨細胞分別植于培養板內的蓋玻片上，待細胞貼壁后再用含3組藥物的血清培養基培養3 d，之后用PBS沖洗，加入4%多聚甲醛固定，0.5 h后用PBS沖洗。隨后用85%、95%、100%的乙醇溶液脫水，脫水結束，用PBS沖洗，再用0.3%的H2O2浸泡，0.5 h后用PBS沖洗，37℃下用封閉液封閉20 min，吸去封閉液，分別滴加COL-Ⅱ、MMP-13Ⅰ抗，過夜。于第2日，再用PBS沖洗，滴加COL-Ⅱ、MMP-13Ⅱ抗，37℃溫度下孵育，之后用PBS緩沖液沖洗，滴加抗生蛋白鏈菌素，再用PBS洗滌，滴加顯色液顯色，鏡下觀察，待其顯色時用PBS洗滌終止上述反應。然后，滴加蘇木素，用雙蒸水洗滌，滴加鹽酸-乙醇進行分化，再次用95%、100%的乙醇脫水，封片，將其置于倒置顯微鏡下，觀察并用圖像分析系統采片。

1.5.2免疫組化結果統計每張切片鏡下隨機取5個高倍視野（×400），記錄每張切片的染色程度以及染色范圍。其中，染色程度分為弱（+）、中（++）、強（+++）3個等級。染色范圍分為染色范圍占視野＜1/4（+）、1/4～2/4（++）、2/4～3/4（+++）、＞3/4（++++）。將染色程度和染色范圍換算成染色指數，染色指數=染色程度×染色范圍，其中將“+”、“++”、“+++”、“++++”分別按1、2、3、4分計算。

1.6統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行分析，MTT結果為計量資料，屬正態分布，方差齊，用多組間均數兩兩比較的方差分析（LSD檢驗），免疫組化染色結果用Kruskal-Wallis檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同組別藥物對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞增殖的影響

在同一時間點上，分別在2.5%、5%、10%濃度中，中藥組較西藥組、對照組MTT差異均有統計學意義（P＜0.01），西藥組較對照組MTT差異均有統計學意義（P＜0.01）。在同一的時間點上，中藥組、西藥組中，10%濃度較5%、2.5%濃度的MTT差異均有統計學意義（P＜0.01），5%濃度較2.5%濃度MTT差異均有統計學意義（P＜0.01）；在對照組中，2.5%、5%、10%濃度三者之間MTT差異均有統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1　不同組別藥物對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞增殖的影響（±s，MTT值）

表1　不同組別藥物對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞增殖的影響（±s，MTT值）

注：與同一時間點不同濃度中藥組相比，**P＜0.01；與同一時間點不同濃度對照組相比，▲▲P＜0.01；同組各濃度兩兩比較，△△P＜0.01。

組別中藥組西藥組對照組濃度（%）2.5 5 10 2.5 5 10 2.5 5 10第1天0.423±0.021△△0.626±0.058△△0.812±0.051△△0.238±0.023**▲▲△△0.389±0.041**▲▲△△0.496±0.092**▲▲△△0.145±0.015** 0.144±0.011** 0.152±0.026**第2天0.636±0.038△△0.848±0.034△△1.086±0.092△△0.451±0.022**▲▲△△0.678±0.037**▲▲△△0.786±0.042**▲▲△△0.263±0.021** 0.271±0.043** 0.253±0.022**第3天1.369±0.024△△1.558±0.036△△1.829±0.017△△0.782±0.076**▲▲△△1.064±0.021**▲▲△△1.352±0.043**▲▲△△0.341±0.023** 0.331±0.035** 0.352±0.023**

2.2COL-Ⅱ和MMP-13免疫組化結果

COL-Ⅱ免疫組化顯示，中藥組細胞顯示強陽性，細胞質、細胞膜均呈現棕黃色；西藥組細胞顯示陽性，細胞質、細胞膜呈現黃色；對照組細胞顯示弱陽性，細胞質、細胞膜呈現淡黃色。MMP-13免疫組化顯示，中藥組細胞顯示弱陽性，細胞核呈現淡黃色；西藥組細胞顯示陽性，細胞核呈現黃色；對照組細胞顯示強陽性，細胞核呈現棕黃色。結果見圖1-2。

2.3COL-Ⅱ和MMP-13免疫組化染色Kruskal-Wallis檢驗結果

COL-Ⅱ免疫組化染色Kruskal-Wallis檢驗結果如下：中藥組與西藥組及對照組相比，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），且中藥組優于西藥組（染色指數χ2=16.26，df=2，P＜0.01）。MMP-13免疫組化染色Kruskal-Wallis檢驗結果如下：對照組與中藥組、西藥組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），且中藥組優于西藥組（染色指數χ2=54.31，df=2，P＜0.01）。結果見表2。

3　討論

膝關節骨性關節炎（KOA）是一種臨床常見的、可導致膝關節軟骨結構發生改變的退變性疾?。?］。軟骨細胞是存在于關節軟骨中的唯一細胞，其功能的異常是導致KOA發生的關鍵［5］。越來越多的研究證實［6］，在KOA發生過程中，細胞因子起著決定性的作用［6］。蛋白膠原是組成膝關節軟骨的主要物質，COL-Ⅱ又是其中最重要的膠原之一，在正常狀態下，它們的存在能夠維持膝關節軟骨正常的組織形態［7］。研究發現，在關節軟骨發生退變時，軟骨細胞中的一些細胞因子也將隨之變化［8］。KOA初期，COL-Ⅱ染色就會發生變化，表層COL-Ⅱ染色下降，深層染色加深［9］。研究認為，基質金屬蛋白酶（MMPs）對軟骨基質巨分子的分解起著主要作用［10］，其中，MMP-13是裂解COL-Ⅱ最強的酶［11］，由軟骨細胞產生，可降解細胞外基質中的蛋白聚糖及COL-Ⅱ［12］。有專家研究表明［13］，在KOA病變部位的軟骨中才發生COL-Ⅱ降解，在正常區域未見變化［14］。另外，研究發現，KOA關節軟骨中還能檢測到MMP-13，且MMP-13基因表達高于正常組織［15］。因此，檢測COL-Ⅱ、MMP-13的表達對于評判軟骨細胞退變意義重大。

圖1　COL-Ⅱ免疫組化結果

圖2　MMP-13免疫組化結果

表2　COL-Ⅱ、MMP-13 Kruskal-Wallis檢驗

膝關節骨性關節炎在中醫學中屬“骨痹”的范疇［16］。中醫認為，肝脾腎虛，風寒濕邪閉阻經絡［17］，氣血不通則導致KOA的關鍵病機，因此，治以調補肝脾腎虛、阻礙風寒濕邪入侵［18］。本研究所用靈仙通絡方，具有活血化瘀止痛、消腫解毒之功效，方中威靈仙具有祛風濕、通絡止痛之功效，配伍白芍以平抑肝陽、養血收陰，配伍防己以行水、瀉下焦濕熱，方中黃芪具有補氣固表、利水退腫、托毒排膿之功效，配伍延胡索以活血、利氣、止痛，配伍全蝎、蜈蚣以息風止痙［19］。本方配伍合理，諸藥相合共奏化瘀止血、活血止痛、解毒消腫之功效?，F代研究表明，靈仙通絡方具有抗炎、抗風濕的作用，對關節病變具有較好的治療作用［20］。

本組研究結果顯示，在不同組別藥物對C518大鼠膝關節退變軟骨細胞增殖的影響上，在同一時間點的不同濃度中，各組之間均有差異；在同一時間點的靈仙通絡組、氨糖美辛組中，各濃度之間亦具有差異。上述結果說明靈仙通絡方對軟骨細胞有明顯的增殖作用。在COL-Ⅱ免疫組化染色中，中藥組與西藥組及對照組相比差異有統計學意義，而西藥組較對照組差異有統計學意義，且中藥組優于西藥組；在MMP-13免疫組化染色中，對照組較中藥組、西藥組差異有統計學意義，而西藥組較中藥組差異有統計學意義，且中藥組優于西藥組。上述結果提示靈仙通絡方能夠通過調節COL-Ⅱ、MMP-13表達來延緩KOA的發生。

綜上所述，C518大鼠膝關節退變軟骨細胞經靈仙通絡方干預后能夠促進其增殖，調節COL-Ⅱ、MMP-13的表達，延緩KOA疾病的發展進程。

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（本文編輯匡靜之）

Effect of Lingxian Tongluo Prescription on the Expression of Cartilage Cell，COL-II and MMP-13 in C518 Rats w ith Knee Joint Degeneration

LIN Qiang1，QIWenbing2，BAIMinghua1，WANG Minghuai1，YU Jigang1，PENG Ye2
（1 Baoji City Chinese Medicine Hospital，Baoji，Shanxi 721000，China；2 Air Force General Hospital，Beijing 100142，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.005

2016-05-10

中國博士后科學基金第八批特別資助（2015T81110）。

林強，男，主治醫師，碩士，研究方向：骨創傷，E-mail：llqq585@163.com。