清熱解毒化濁片對(duì)ETM兔肝組織CD14及TNF-α、IL-1表達(dá)的影響

趙國(guó)榮*，張衎，何宜榮*，艾碧琛，肖碧躍，賀又舜，左亞杰，熊焰，陳蘭玲，尹周安

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007）

清熱解毒化濁片對(duì)ETM兔肝組織CD14及TNF-α、IL-1表達(dá)的影響

趙國(guó)榮1*，張衎2，何宜榮1*，艾碧琛1，肖碧躍1，賀又舜1，左亞杰3，熊焰1，陳蘭玲3，尹周安1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007）

目的探討清熱解毒化濁片對(duì)內(nèi)毒素血癥（Endotoxemia，ETM）模型兔肝功能、肝組織CD14和血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）的影響。方法將21只新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、清熱解毒化濁片組（清化組），每組7只。將模型組及清化組兔沿耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS，10μg/kg），于造模后2 h干預(yù)，灌胃后2 h心臟采血檢測(cè)家兔的肝功能、TNF-α和IL-α的變化，采肝臟組織檢測(cè)CD14及觀察肝臟病理形態(tài)。結(jié)果（1）與模型組比較，清化組ALT、AST上升（P＜0.05），肝組織CD14表達(dá)及血清TNF-α、IL-1下降（P＜0.05）；（2）模型組肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且出現(xiàn)空泡樣改變，清化組及正常組改變不明顯。結(jié)論清熱解毒化濁片能下調(diào)ETM模型兔CDl4、TNF-α和IL-1的表達(dá)，具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的干預(yù)作用，推測(cè)其有阻斷早期LPS誘導(dǎo)信號(hào)通路的作用。

內(nèi)毒素血癥；清熱解毒化濁片；CD14；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1；茵陳；黃芩；滑石

Effect of Qingre Jiedu Huazhuo Tablets on Expression of CD14 in Liver Tissue，TNF-αand IL-1 of ETM Rabbits

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of Qingre Jiedu Huazhuo（QJH）tablets on the expression of CD14，TNF-αand IL-1 in liver tissue of ETM rabbits.M ethods The 21 New Zealand big-eared rabbits were random ly divided into normal group，model group，QJH tablets group，7 in each group.The ear edge of model group and QJH group was given intravenous injection of 10μg/kg endotoxin.After 2 hours of modeling，the rabbites were given intervention.Then，the liver function，TNF-αand IL-1 were tested.The CD14 in liver tissue was determined and the pathological morphology was observed.Results（1）Compared with the model group，the ALT and AST of QJH tablets group were increased（P＜0.05）.The CD14 expression in liver tissue and serum TNF-αand IL-1 were decreased（P＜0.05）.（2）The liver cell array structure of model group was disorder with inflammatory cells infiltration and a cavity change，but the changes in QJH tablets group and blank group were not obvious.Conclusion Qingre Jiedu Huazhuo tablets with multi-point target and munti-effects can decrease CDl4，TNF-αand IL-1 in ETN rabbits，suggesting the tablets have an effect on the signaling pathway induced by LPS in the early days.

〔Keywords〕endotoxemia；Qingre Jiedu Huazhuo tablets；CD14；TNF-a；IL-1；oriental wormwood；radix scutellariae；talc

研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)清熱解毒化濁片（簡(jiǎn)稱化濁片）進(jìn)行了大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)其不僅可用于治療病毒性肝炎肝損傷，還可清除內(nèi)毒素［1-3］。本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)毒素血癥（Endotoxemia，ETM）兔為研究對(duì)象，觀察清熱解毒化濁片對(duì)家兔肝功能、CD14、TNF-α、IL-1及肝臟病理形態(tài)的影響，以期為該藥臨床運(yùn)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體質(zhì)量1.8-2.5 kg，由長(zhǎng)沙市東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2藥物清熱解毒化濁片（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：20100908），規(guī)格為0.3 g/片，成人一般劑量為10片/次，3次/d，一天劑量為9 g。根據(jù)《中醫(yī)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)》［4］將清熱解毒化濁片配制成濃度為0.04 g/mL的藥液（下稱藥液）。兔灌胃量為0.4 g/kg。藥液放4℃冰箱保存。

1.1.3主要試劑與儀器（1）試劑大腸桿菌內(nèi)毒素（Esch erichia coil 0111∶B4，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：118K4052）、鰲試劑盒（美國(guó)ACC北京科德角生物技術(shù)有限公司代理，批號(hào)：249018）、兔Anti-NF-kBp65（批號(hào)：306428）、SABC免疫組化染色試劑盒（兔IgG批號(hào)：SA1022）、DAB顯色劑試劑盒（批號(hào)：AR1022）、抗體稀釋液（批號(hào)：C-0007）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。（2）儀器MK3酶標(biāo)儀，芬蘭LABSYSTBA集團(tuán)；TDZ5-4.0多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，長(zhǎng)沙天創(chuàng)儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1分組及造模［5］將21只兔隨機(jī)分為3組，即正常組、模型組、清熱解毒化濁片組（簡(jiǎn)稱清化組），每組7只。家兔正常飼養(yǎng)3 d，每天測(cè)量肛溫3次，取平均值為基礎(chǔ)體溫，并記錄各組家兔的一般情況［5］，第3天開(kāi)始造模，將模型組、清化組按10μg/kg經(jīng)耳緣靜脈注射內(nèi)毒素，正常組注入同體積無(wú)菌生理鹽水。

1.2.2藥物干預(yù)及標(biāo)本采集根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)［6-7］，造模后至2 h每20分鐘測(cè)量體溫1次，并記錄開(kāi)始發(fā)熱時(shí)間，兔在2 h內(nèi)，體溫升高，心率、呼吸增快，聳毛、發(fā)抖、噴嚏。造模2 h時(shí)，清化組用清熱解毒化濁片藥液10 mL/kg灌胃1次；正常組與模型組分別以10 mL/kg溫開(kāi)水灌胃1次。灌胃后同樣每20分鐘測(cè)1次體溫，并記錄各組兔癥狀、體征。

灌胃后2 h，清化組體溫下降，心率、呼吸恢復(fù)正常，聳毛、發(fā)抖、噴嚏等消失，但與之相對(duì)應(yīng)的模型組體溫仍在升高，心率、呼吸恢復(fù)加快，聳毛、發(fā)抖、噴嚏等癥仍存，此時(shí)對(duì)正常組、模型組、清化組兔進(jìn)行心臟采血，每只兔分別用肝素鈉抗凝管兩支各取血3 mL用于檢測(cè)肝功能、TNF-α、IL-1。取血完畢后，從耳緣靜脈注入烏拉坦3 mL/kg，在麻醉狀態(tài)下取肝臟右下葉組織，備做病理形態(tài)、免疫組化檢測(cè)CD14。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1肝功能測(cè)定由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定。

1.3.2TNF-α、IL-1檢測(cè)將各組血清標(biāo)本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TNF-α、IL-1檢測(cè)。

1.3.3免疫組化檢測(cè)CD14將切片脫蠟至水。按照盒試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)操作。最后蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化后自來(lái)水沖洗10-15 min，脫水、透明、封片、400倍光學(xué)顯微鏡下觀察拍片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析得出CD14的平均光密度值。

1.3.4肝細(xì)胞HE染色取肝臟右葉組織，以4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋切片，然后使用平推式切片機(jī)連續(xù)切片，切片載入載玻片后予行HE染色，染色時(shí)間為10 min左右，切片厚度約5μm，400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察拍片。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。全部計(jì)量資料以“±s”表示，首先進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)。滿足正態(tài)性者，不同組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并進(jìn)行組間的多重比較；方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3法；不滿足正態(tài)性時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1清熱解毒化濁片對(duì)家兔內(nèi)毒素血癥肝功能的影響

造模后，模型組與正常組比較，模型組ALT、AST均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后，清化組與模型組比較，清化組ALT、AST均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　清熱解毒化濁片對(duì)肝功能的影響（±s，n=7，U/L）

表1　清熱解毒化濁片對(duì)肝功能的影響（±s，n=7，U/L）

注：與正常組比，△P＜0.05；與模型組比，▽P＜0.05。

組別ALT AST正常組55.2±3.49 50.3±4.25模型組49.6±4.83△45.2±3.82△清化組56.7±1.2▽49.6±2.1▽

2.2清熱解毒化濁片對(duì)家兔內(nèi)毒素血癥肝臟組織CD14及血清細(xì)胞因子的影響

造模后，模型組與正常組比較，模型組肝臟組織CD14、血清TNF-α、IL-1水平均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)過(guò)治療后，清化組與模型組比較，清化組肝臟組織CD14、血清TNF-α、IL-1水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

從免疫組化圖中可見(jiàn)，正常組肝臟沒(méi)有CD14陽(yáng)性表達(dá)（圖1-A），模型組周圍肝血竇及肝細(xì)胞有CD14陽(yáng)性大量表達(dá)（圖1-B）；清化組有少量CD14陽(yáng)性表達(dá)（圖1-C）。

表2　清熱解毒化濁片對(duì)肝臟組織CD14以及血清TNF-α、IL-1的影響（±s，n=7）

表2　清熱解毒化濁片對(duì)肝臟組織CD14以及血清TNF-α、IL-1的影響（±s，n=7）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別CD14 TNF-α（ng/L）IL-1（ng/L）正常組1.17±0.29 56.7±8.4 4.40±0.96模型組2.56±0.22△75.8±16.3△9.94±2.40△清化組1.28±0.41▲58.7±7.0▲5.30±1.01▲

圖1　肝臟組織CD14表達(dá)光鏡圖（免疫組化×400）

2.3清熱解毒化濁片對(duì)家兔ETM肝損傷肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響

正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)變性、壞死炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2-A）；模型組肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣改變（圖2-B）；清化組炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞腫大及空泡樣變性不明顯（圖2-C）。

圖2　肝臟病理形態(tài)學(xué)光鏡圖（HE×400）

3　結(jié)論

LPS進(jìn)入機(jī)體刺激并促發(fā)細(xì)胞上TLR4信號(hào)通路CDl4等表達(dá)引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，編碼一系列炎癥因子，釋放TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中清化組的CDl4、TNF-α、IL-1較模型對(duì)照組明顯降低，且有顯著性差異，與正常組比較無(wú)顯著性差異，說(shuō)明清熱解毒化濁片可以下調(diào)CDl4的表達(dá)，減少LPS的識(shí)別及跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使促炎因子TNF-α的表達(dá)減少，可避免后續(xù)細(xì)胞因子的瀑布式釋放及抗炎/促炎失衡。清化組下游促炎因子IL-1的合成減少，也證實(shí)清熱解毒化濁片對(duì)信號(hào)通路中CDl4、TNF-α、IL-1起到調(diào)控作用。

肝臟作為人體內(nèi)唯一代謝內(nèi)毒素的器官，內(nèi)毒素及各種炎癥介質(zhì)直接或間接造成肝功能損傷，而出現(xiàn)肝功能改變，但因?yàn)榇藢?shí)驗(yàn)為急性試驗(yàn)，攻毒時(shí)間不長(zhǎng)，故肝功能損傷不是很重。但從肝臟病理形態(tài)上發(fā)現(xiàn)其損傷還是較重，病理形態(tài)圖片顯示：模型組肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣改變。經(jīng)過(guò)清熱解毒化濁片治療后清化組炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞腫大及空泡樣變性不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在內(nèi)毒素血癥早期使用清熱解毒化濁片干預(yù)后，內(nèi)毒素水平下降，肝細(xì)胞ALT、AST升高恢復(fù)活性，血漿內(nèi)毒素及肝臟組織結(jié)構(gòu)受損呈平行關(guān)系。由于清熱解毒化濁片可使CDl4表達(dá)下調(diào)，從而減少前炎癥細(xì)胞因子生成與釋放，內(nèi)皮細(xì)胞激活受限，致使白細(xì)胞浸潤(rùn)和微血栓不能形成及炎癥反應(yīng)進(jìn)一步放大被阻斷；清化組TNF-α、IL-1下降，ALT、AST活性恢復(fù)升高。因此清熱解毒化濁片治療內(nèi)毒素血癥肝損傷調(diào)控TLR4信號(hào)通路是多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)。

在前期的實(shí)驗(yàn)研究中，無(wú)論是急性、慢性肝病，基本病機(jī)為“濕、熱、毒、濁”［2］。因此有人研究發(fā)現(xiàn)溫病衛(wèi)、氣、營(yíng)、血階段中均存在內(nèi)毒素血癥［7］，并且與溫病衛(wèi)氣營(yíng)血辨證具有相關(guān)性［6］，故本研究攻毒后2 h相當(dāng)于衛(wèi)分證階段，在該時(shí)期初期使用清熱解毒，化濁利濕之法，以達(dá)到驅(qū)邪外出并促進(jìn)機(jī)體自身免疫功能恢復(fù)的目的。清熱解毒化濁片中有茵陳、滑石、黃芩三藥清熱利濕；石菖蒲、藿香辟穢和中，宣濕濁之壅滯；白蔻仁芳香悅脾，令氣暢而濕行；木通清利濕熱，導(dǎo)濕熱從小便而去；連翹、貝母清熱解毒、散結(jié)消腫。諸藥合用，重在清熱利濕，使?jié)裥暗萌ィ瑹岫镜们澹瑲鈾C(jī)調(diào)暢。

［1］趙國(guó)榮，曹軍連，謝靜，等.不同劑量清熱解毒化濁片對(duì)大鼠免疫性肝損傷治療作用的對(duì)比研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2004，l4（1）：23-25.

［2］謝靜，趙國(guó)榮，熊焰，等.清熱解毒化濁片對(duì)慢性病毒性肝炎濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、肝郁脾虛證療效的研究［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，23（6）：33-35.

［3］肖碧躍，越國(guó)榮，艾碧琛，等.清熱解毒化濁片對(duì)病毒性肝炎肝損害療效觀察［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（7）：49-50.

［4］賀石林，王建，王凈凈.中醫(yī)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2003：20-21.

［5］艾碧琛，趙國(guó)榮，賀又舜，等.探討內(nèi)毒素血癥兔復(fù)制衛(wèi)氣營(yíng)血可能性的實(shí)驗(yàn)體會(huì)［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28（5）：23-25.

［6］趙國(guó)榮，艾碧琛，賀又舜，等.內(nèi)毒素血癥兔癥狀、體征動(dòng)態(tài)變化與衛(wèi)氣營(yíng)血傳變的相關(guān)性［J］.中醫(yī)雜志，2011，52（15）：1305-1307.

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（本文編輯楊瑛）

ZHAO Guorong1*，ZHANG Kan2，HE Yirong1*，AI bichen1，XIAO Biyue1，HE Youshun1，ZUO Yajie3，XIONG Yan1，Chen Lanling3，YIN Zhouan1
（1.College of TCM，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2．The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530023，China；3.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.006

2015-12-06

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目資助（12A101）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床基礎(chǔ)重點(diǎn)學(xué)科資助；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)青年基金（校行科字［2013］4號(hào)）資助。

*趙國(guó)榮，女，二級(jí)教授，主任醫(yī)師，E-mail：zhaoguorong1116@sina.com；何宜榮，男，講師，主治醫(yī)師，E-mail：260124907@qq.com。