柴芍乳癖顆粒對乳腺增生兔模型B超聲像及組織形態學的影響

楊春萍，劉麗芳*，楊濤，聶佳欣，高雙雙，胡文文

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；3.湖南省第二人民醫院，湖南長沙410007）

柴芍乳癖顆粒對乳腺增生兔模型B超聲像及組織形態學的影響

楊春萍1，劉麗芳2*，楊濤1，聶佳欣1，高雙雙1，胡文文3

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；3.湖南省第二人民醫院，湖南長沙410007）

目的觀察柴芍乳癖顆粒對乳腺增生病兔模型乳腺組織B超聲像及組織形態學的影響。方法56只健康未孕新西蘭雌兔，隨機挑出10只為正常對照組，肌注生理鹽水；46只為模型制備組，序貫肌注雌孕激素造模。2組均隨機處死1只雌兔，觀察病理切片確定造模成功后，將模型制備組剩下的45只兔再隨機分為5組：模型對照組、乳癖散結顆粒組、柴芍乳癖顆粒低、中、高劑量組。6組兔每天分別予以生理鹽水、乳癖散結顆粒（0.56 g/kg）、柴芍乳癖顆粒（0.47、0.94、1.88 g/kg）水溶液灌胃1次，連續3月。末次灌胃24 h后麻醉，用B超機采集第2對乳房的聲像圖，處死后取第2對乳腺組織，HE染色觀察組織形態學表現，計數乳腺小葉腺泡數、導管上皮細胞層數、腺泡腔直徑。結果柴芍乳癖顆粒能使模型兔乳腺組織低回聲區縮小，內部回聲強度減低，其中高劑量組最明顯；與模型組相比，柴芍乳癖顆粒低、中、高劑量跟乳癖散結顆粒均可明顯縮小腺泡腔直徑（P＜0.01），中、高劑量可以減少乳腺導管上皮細胞層數，低劑量還可減少乳腺小葉腺泡數（P＜0.05）。結論柴芍乳癖顆?？梢愿纳迫橄僭錾媚Ｐ虰超聲像，減輕雌兔乳腺增生程度，治療乳腺增生效果明顯。

乳腺增生；柴芍乳癖顆粒；B超聲像；組織形態學；柴胡

〔Abstract〕Objective To observe the effect of Chaishao Rupi Granules on B type ultrasound images and histomorphology of rabbit models with breast hyperplasia.M ethods 10 rabbits were random ly selected from 56 healthy unfertilized female New Zealand rabbits as the normal control group，which were given muscle injection with normal saline，46 rabbits as model preparation group，which were taken female progestogen sequential muscle injection.Random ly killing female rats in the two groups，determine the model is successful or not by observing the pathological section.The remaining 45 rabbits in model preparation group were divided into 5 groups：model control group，Rupi Sanjie granule group，and low dose，middle dose，high dose of Chaishao Rupi granules groups.The six groups were administrated normal saline，0.56 g/kg Rupi Sanjie granules，and 0.47 g/kg，0.94 g/kg，1.88 g/kg Chaishao Rupi granules，respectively，once a day，continuous for 3 months.At 24 h after the last lavage，we implemented the anesthesia to all of the rabbits and collected the second pair of breasts'B ultrasound images. We cut the second pair of breast tissue out.The histomorphology after HE staining was observed.The numbers of lobular acini，duct epithelial layer and acinus cavity diameter were counted.Results Chaishao Rupi granules can shrink the rabbit model's breast tissue keyed acoustic area，decrease internal echo intensity，the effect of high dose group is the most obvious.Compared with model group，three doses of Chaihu Rupi granules and Rupi Sanjie granules can narrow the acinus cavity diameter significantly（P＜0.01）.The middle dose and high dose can reduce the mammary ductal epithelial cell layers（P＜0.05），low dose can also reduce lobular acini number（P＜0.05）.Conclusion Chaishao Rupi granules can improve B ultrasonicimage of mammary gland hyperplasia rabbit models，can reduce the degree of female rabbits'hyperplasia of mammary glands. The effect on hyperplasia of mammary glands is obvious.

〔Keywords〕hyperplasia of mammary glands；Chaishao Rupi granules；B type ultrasound images；histomorphology

乳腺增生病（hyperplasia of mammary glands，HMG）是乳腺組織的一種既非炎癥也非腫瘤性病變。據調查，70%～80%的女性都有不同程度的乳腺增生［1］。HMG是最常見的乳房疾病［2］，且有癌變可能。終末導管小葉單位→普通增生→非典型增生→原位癌→浸潤性癌→轉移癌是連續演變的，但在出現“原位癌”之前上述進程是可逆的。積極治療乳腺增生，既能解除廣大患者的痛苦，又能避免發展為乳腺癌。

導師劉麗芳教授根據多年臨床經驗創制出柴芍乳癖湯，已經在臨床上采用中藥配方顆粒的形式運用多年。經前期臨床觀察表明：柴芍乳癖湯能在一定程度上控制乳腺增生癥狀［3］。但目前尚無柴芍乳癖顆粒對乳腺組織產生影響的直觀證據。本次動物實驗通過創建兔HMG模型，觀察兔乳腺組織的B超聲像及組織形態學表現，以期直觀驗證柴芍乳癖顆粒對HMG的療效。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物健康未孕雌性新西蘭白兔56只，體質量1.7～2.5 kg，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，使用許可證編號：SYXK（湘）2013-0005。

1.1.2藥物柴芍乳癖顆粒（簡稱CSRPKL）：柴胡、白芍、當歸、青皮、郁金、瓜蔞皮、浙貝母、莪術、橘核、牡蠣、夏枯草、王不留行、白術、茯苓（一方中藥配方顆粒），由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供；乳癖散結顆粒（簡稱RPSJKL）：陜西白鹿制藥股份有限公司，4 g/袋，批號150503。

1.1.3主要試劑苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠，批號140910）、黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號140706）、0.9%氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司，批號G141201F）、8%硫化鈉水溶液、10%甲醛溶液、巴比妥鈉等分析純試劑。

1.1.4主要儀器尼康CI-1研究型正置熒光顯微鏡；Motic BA410研究型顯微鏡（加拿大麥克奧迪）；Motic 6.0數碼醫學圖像分析系統（加拿大麥克奧迪）；M5邁瑞便攜式彩色B超機（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；萊卡RM2235輪轉石蠟切片機；金迪YD-A生物組織攤片機；DNP-9162電熱恒溫培養箱（上海一恒）。

1.2方法

1.2.1HMG模型兔的創建56只兔編號1-56，抓鬮法隨機挑出10只為正常對照組編號Z1-Z10、剩余46只為模型制備組，編號M1-M46，參考文獻［4］造模方法，正常對照組雙大腿內外側肌肉豐厚處交替肌注生理鹽水，1次/d，連續30 d；模型制備組肌注（獸用）苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，1次/d，連續25 d，隨后肌注（人用）黃體酮1 mg/kg，隔天1次，共3次。末次肌注24 h后將兔腹部脫毛觀察乳房大體變化情況，兩組均隨機挑出1只兔處死，取第2對乳房做病理切片，顯微鏡下觀察乳腺組織形態，確認造模成功。

1.2.2分組與給藥將造模后的45只雌兔，按體質量由低到高編號1-45，用隨機數字表法隨機編入模型對照組、RPSJKL組和CSRPKL低、中、高劑量組5個組，加上正常對照組，共6個組，每組9只。采用灌胃給藥，1次/d，連續3月。按照徐叔云［5］《藥理實驗方法學》體表面積法換算，CSRPKL中劑量組和RPSJKL組換算為臨床日用量等效劑量，低、中、高劑量組按1∶2∶4的比例用藥。每只兔每日灌胃藥量分別為RPSJKL組0.56 g/kg、CSRPKL低劑量組0.47 g/kg、中劑量組0.94 g/kg、高劑量組1.88 g/kg。正常對照組、模型對照組兔灌同體積的生理鹽水。

1.2.3B超聲像采集及病理取材造模后及末次灌胃后24 h，用5%巴比妥鈉200 mg/kg腹腔注射麻醉，仰面固定在解剖臺上，先剪短腹部（鎖骨→腹股溝）被毛，再均勻涂抹8%硫化鈉水溶液，幾分鐘后待被毛變成黃色粘稠液態物質，抹布蘸溫水擦凈，觀察乳房大體變化，標號拍照。末次灌胃標號拍照后，用便攜式彩超機采集第2對乳房的B超聲像圖，然后空氣栓塞致死，剪取第2對乳房。

1.2.4病理切片的制作與染色（1）固定：將離體組織標本在10%甲醛溶液中浸泡24 h以上；（2）脫水、透明、石蠟包埋；（3）切片：蠟塊連續切片，厚約4μm；（4）HE染色：①二甲苯連續脫蠟2次，10 min/次；②梯度酒精復水，2～5 min/次；③蘇木素染色，5～10 min；④水洗時間隨機；⑤藍化時間隨機；⑥伊紅液染色，1～3 min；⑦梯度酒精脫水，2～5 min/次；⑧二甲苯兩步透明；（5）中性樹脂封片，標號及標示左右。

1.2.5組織形態學觀測用Motic BA410研究型顯微鏡在10×10倍光鏡下觀察經HE染色后的病理切片，用Motic 6.0數碼醫學圖像分析系統采集圖像，每只兔觀測左、右二張切片，每張切片觀測4個視野，計數每個視野中乳腺小葉腺泡數、腺泡腔直徑和導管上皮細胞層數，取4個視野的平均值作為該切片的數值，取左、右二張切片的平均值作為該只兔的最終值。

1.3統計學處理

2　結果

2.1造模后乳房大體變化

末次肌注激素24 h后將兔腹部脫毛，觀察見：兩組雌兔各乳頭均充血增大，其中第2對最明顯（正常對照組見圖1A，模型制備組見圖1B）。

圖1　兔腹部4對乳房大體照片

2.2HMG兔模型的評價

顯微鏡下觀察處死的正常對照組和模型制備組雌兔的乳腺組織病理切片，可見正常乳腺組織（圖2A）小葉腺胞數較少，導管上皮細胞排列整齊，導管腔基本無擴張。模型制備組（圖2B）乳腺小葉腺泡數增加，導管上皮細胞層數增加、結構紊亂，腺泡腔明顯擴張，腔內可見脫落的上皮細胞及分泌物，參考文獻［6］標準，可以判定造模成功。

2.3干預后乳房B超聲像表現

正常對照組（圖3A）乳腺腺體層不增厚，模型對照組（圖3B）乳腺腺體增厚，回聲強弱不一，內部光點增粗，回聲區形狀近似介于橢圓形和梭形之間，藥物干預后，RPSJKL組（圖3C）和CSRPKL低劑量組（圖3D）乳腺組織稍厚，低回聲區呈長條形，其中RPSJKL組的面積小于低劑量組；中劑量組（圖3E）乳腺組織類似半橢圓形，中央回聲稍高；高劑量組（圖3F）乳腺組織低回聲區比RPSJKL組和低劑量組窄、厚，邊界較模糊，形態略不規整。

圖2　兔第2對乳腺組織病理切片光鏡圖（HE×100）

圖3　兔乳房B超聲圖像

2.4干預后兔乳腺組織病理形態學情況

由于實驗正值梅雨季及酷夏，動物飼養環境一般，加之實驗人員操作不熟練、動物不配合等原因，灌胃3月后僅剩44只雌兔。其中，模型對照組1只兔因奮力反抗肌注、灌胃等操作而雙下肢癱瘓，1只被野鼠咬傷感染而亡；CSRPKL低劑量組因藥液灌至肺內死亡2只，腹瀉死亡1只；中劑量組死亡2只，高劑量組死亡3只，解剖見肺內有藥液殘留、胸腔大量炎性積液。6組雌兔第2對乳腺組織病理切片詳見圖4。

圖4　兔乳腺組織病理切片光鏡圖（HE×100）

與正常對照組相比，模型對照組乳腺小葉腺泡數、導管上皮細胞層數增多（P＜0.05），腺泡腔直徑顯著擴張（P＜0.01），造模效果好。干預后，與模型組相比，CSRPKL低劑量組乳腺小葉腺泡數減少（P＜0.05），CSRPKL中、高劑量組導管上皮細胞層數減少（P＜0.05），RPSJKL組及CSRPKL低、中、高劑量組腺泡腔直徑均明顯縮?。≒＜0.01）。結果見表1。

表1　各組乳腺小葉腺泡數、導管上皮細胞層數、腺泡腔直徑比較（±s）

表1　各組乳腺小葉腺泡數、導管上皮細胞層數、腺泡腔直徑比較（±s）

注：與正常對照組相比，●P＜0.05，●●P＜0.01；與模型對照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別n正常對照組模型對照組RPSJKL對照組CSRPKL低劑量組CSRPKL中劑量組CSRPKL高劑量組9 7 9 6 7 6乳腺小葉腺泡數（個）4.58±3.65 10.42±4.27●6.90±2.50 4.75±2.26▲6.92±3.37 5.83±2.76導管上皮細胞層數（層）1.07±0.65 2.25±0.45●1.83±0.39 1.65±0.45 1.43±0.49▲1.43±0.49▲腺泡腔直徑（μm）56.73±12.80 108.85±24.88●●79.04±23.04▲▲73.81±19.78▲▲67.48±13.50▲▲73.07±16.74▲▲

3　分析與討論

HMG主要病因為內分泌失調，屬慢性疾病。目前，診斷HMG的首選檢查方法是B超［7］，無創、可反復使用；確診HMG的方法是病理檢查，但有創，患者不易接受。常用治療HMG的西藥有激素類、維生素類、碘制劑、利尿消腫藥和止痛劑。激素類藥物會加重機體內分泌失調，停藥后乳房疼痛加重，出現子宮內膜增厚甚至癌變、月經不調等副反應；碘制劑有導致甲狀腺功能障礙的風險；維生素類沒有直接抗增生作用，療效不確切；利尿消腫藥和止痛劑也是“治標不治本”。而據統計，中醫藥治療HMG的平均有效率為（93.50±6.45）%［8］，能有效控制HMG的臨床癥狀，副反應也較少。因此，對臨床療效顯著的柴芍乳癖顆粒開展相關研究具有較高價值和重要意義。

HMG以乳房疼痛和腫塊為主要臨床表現，屬中醫學“乳癖”范疇，由郁怒傷肝、思慮傷脾、氣滯血瘀、痰凝成核，氣、血、痰三者夾雜同時致?。?］。柴芍乳癖顆粒由14味中藥組成，針對乳癖的病因病機，方中君藥柴胡疏肝解郁，白芍養血斂陰、柔肝止痛；臣藥青皮疏肝破氣、消積化滯，郁金活血止痛、行氣解郁，白術和茯苓益氣健脾、利水滲濕，當歸活血補血，佐藥瓜蔞皮、浙貝母和橘核清熱化痰、理氣寬胸、散結止痛，使藥川楝子行氣止痛，王不留行活血通經，莪術破血行氣、消積止痛，丹參活血祛瘀止痛，牡蠣軟堅散結，夏枯草清肝瀉火、散結消腫。諸藥合用，共奏疏肝理氣、健脾益氣、除濕化痰、活血化瘀、散結止痛之功。

本研究通過創建模擬人類HMG的兔模型，進行長期藥物干預實驗，既能減輕患者的痛苦，又能減少患者依從性不高對實驗結果的影響。通過研究發現：在B超聲像方面，柴芍乳癖顆粒能縮小增生乳腺組織回聲區范圍，降低乳腺組織內部回聲強度。在乳腺組織病理形態學方面，柴芍乳癖顆粒減輕增生的作用是值得肯定的，低劑量組能減少乳腺小葉腺泡數，中、高劑量組可以減少導管上皮細胞層數，低、中、高劑量組均能明顯縮小腺泡腔直徑。但與正常對照組相比，各用藥組均未恢復至乳腺無增生狀態，可能與中藥起效慢有關。另外，從乳房大體照片上可以看出：實驗中正常對照組雌兔乳頭亦充血增大，可能與兔齡增長自然發育有關，屬正常生理現象，病理切片顯示兔乳頭充血增大與乳腺組織增生無必然聯系。

目前，中醫藥治療HMG的動物實驗多采用小鼠、大鼠造模，采用兔的很少，而且已查閱到的文獻內建立HMG動物模型的部分激素已經停產。因此，本實驗參考前人研究成果，創新性采用獸用激素注射液進行造模，并在激素使用劑量和次數上進行探索。實驗發現：肌注（獸用）苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，1次/d，連續25 d，隨后肌注（人用）黃體酮注射液1 mg/kg，隔天1次，共3次，可創建出HMG兔模型。病理觀測造模效果好，希望對后續研究者起到一定的參考作用。本文的造模方法前期僅進行過1次預實驗，模型的重復性和穩定性有待后續研究者進一步實驗后評判。

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［3］王月，劉麗芳.柴芍乳癖湯治療乳腺增生病療效觀察［J］.廣西中醫藥，2012，1：14-15.

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［5］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛生出版社，2002：1861.

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［8］劉曉雁，劉鵬熙，李廣曦.乳腺增生癥的中醫辨證用藥規律分析［J］.江蘇中醫藥，2007，39（6）：53.

［9］劉靖，靳小磊，耿剛.乳腺增生病發病因素的分析［J］.內蒙古中醫學，2010，29（5）：121-123.

（本文編輯楊瑛）

Effects of Chaishao Rupi Granules on B Type Ultrasound Images and Histomorphology of Rabbit M odels w ith Breast Hyperp lasia

YANG Chunping1，LIU Lifang2*，YANG Tao1，NIE Jiaxin1，GAO Shuangshuang1，HU Wenwen3
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；3.Hunan Second People's Hospital，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.007

2015-12-06

楊春萍，女，碩士，研究方向：中醫外治法。

〔通迅作者〕*劉麗芳，女，教授，主任醫師，博士研究生導師，E-mail：liulff@126.com。