IL-17在米非司酮誘導的早產大鼠模型外周血中的表達水平及其意義

鮑俊杰　葉愛華　邱先桃　施少清　劉慧姝

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·基礎研究論著·

IL-17在米非司酮誘導的早產大鼠模型外周血中的表達水平及其意義

鮑俊杰葉愛華邱先桃施少清劉慧姝

目的探討米非司酮誘導的早產大鼠模型外周血中IL-17的表達水平及其意義。方法 SPF級10～12周齡Sprague-Dawley大鼠適應性喂養1周后雌雄合籠，陰道涂片發現精子者標記為妊娠第1日。將8只孕鼠隨機分為對照組與早產組，每組4只。 早產組大鼠在妊娠第18日皮下注射米非司酮10 mg/kg，建立米非司酮誘導的早產大鼠模型，對照組大鼠在相同時間注射芝麻油，分別于注射后6 h及24 h采集2組大鼠外周血，檢測血清中IL-17、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平。比較早產組和對照組間IL-17、GM-CSF水平的差異。結果早產組大鼠在妊娠第18日皮下注射米非司酮后的發動分娩時間間隔明顯短于皮下注射芝麻油的對照組(P<0.01)。早產組大鼠在注射米非司酮后6 h時血清IL-17水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，24 h時血清IL-17水平高于對照組(P<0.01)。2組大鼠在注射米非司酮后6、24 h時血清GM-CSF水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論米非司酮誘導的早產大鼠外周血中IL-17水平升高，提示炎癥因子IL-17可能參與了激素誘導的早產發生過程。

米非司酮；白介素-17；早產；大鼠

我國將早產定義為自末次月經第1日開始在孕28周至不滿37周間終止妊娠者，其發病率為5%～15%[1]。盡管圍生醫學水平在不斷提高，早產仍為導致新生兒死亡和患病的首要原因。早產與激素、感染、免疫、遺傳及環境等多種因素相關[2]。雖然其確切的發病機制尚未闡明，但有研究提示炎癥因素在早產的發生中起重要作用。有研究報道，炎癥因子IL-17在感染引起的早產病例中顯著增加，然而IL-17是否參與促進激素誘導的早產發生目前未見報道[3]。本研究通過建立米非司酮誘導的早產大鼠模型，對比IL-17在早產組和對照組外周血中水平的差異，探討炎癥因子IL-17可能在激素誘導的早產中的作用。

材料與方法

一、實驗動物

SPF級Sprague-Dawley大鼠(10～12周齡，200～400 g)，購于廣東省實驗動物中心，自由攝食及飲水，光照時間為上午6點至下午6點，室溫23～26 ℃，相對濕度30%～80%，定期紫外線消毒，通風良好。本研究經廣州醫科大學倫理委員會批準。

二、方法

1. 動物模型的建立

參照Garfield等[4]的方法建立動物模型：經過隔離檢疫并適應性喂養1周后按雌雄小鼠4∶1合籠，次晨行陰道涂片，鏡檢發現精子者標記為妊娠第1日。將8只孕鼠按隨機數字表法分為對照組與早產組，每組4只。在妊娠第18日，早產組予經皮下注射米非司酮10 mg/kg(預溶于0.3 ml芝麻油)；對照組大鼠在相同時間點注射等體積的芝麻油。

2. 外周血IL-17、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)水平的檢測

SD大鼠在妊娠第18日經皮下注射米非司酮或芝麻油6 h和24 h后，分別從眼眶取血約0.5 ml，離心后取上層血清，采用液相芯片法(eBioscience)檢測血清中IL-17、GM-CSF的水平。測定完全按照試劑盒說明書進行：準備相應的標準品S1-S8及檢測樣品；預混抗體微球并加入96孔板，每孔50 μl，洗滌孔板2次；加入25 μl 分析緩沖液至96孔板，然后加入25 μl 標準品及25 μl 血清樣本至對應含抗體微球的96孔板中，封板膜密封孔板，避光室溫500 rpm振蕩孵育2 h；洗滌孔板3次，稀釋探測抗體并向每孔加入25 μl，封板膜密封孔板，避光室溫500 轉/分振蕩孵育30 min；洗滌孔板3次，每孔加入50 μl SA-PE溶液，封板膜密封孔板，避光室溫500轉/分振蕩孵育30 min；洗滌孔板3次，加入120 μl 上機液重懸微球，500轉/分震蕩5 min后上機讀數，根據標準曲線計算出樣本中IL-17及GM-CSF的水平。

三、統計學處理

結　　果

一、早產組與對照組大鼠分娩發動時間間隔比較

2組大鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)，早產組大鼠在妊娠第18日皮下注射米非司酮后的發動分娩時間間隔短于皮下注射芝麻油的對照組(P<0.01)，見表1。2組大鼠均無發生其他并發癥。

表1 早產組與對照組大鼠體質量、

二、早產組與對照組大鼠的血清IL-17、GM-CSF水平比較

早產組大鼠在皮下注射后6 h與24 h的血清IL-17水平比較差異有統計學意義(P<0.01)，2個時間點間血清GM-CSF水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。皮下注射后6 h，早產組大鼠在血清IL-17水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；皮下注射后24 h，早產組大鼠血清IL-17水平高于對照組(P<0.01)；早產組大鼠在皮下注射后6 h與24 h的血清GM-CSF水平與對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表2及圖1。

表2 早產組與對照組大鼠血清IL-17、GM-CSF水平比較　ng/L

圖1　早產組與對照組大鼠血清IL-17、GM-CSF水平變化及比較

A：血清IL-17水平，*P<0.01；B：GM-CSF水平

討　　論

在全球范圍內，早產的發病率達5%～18%，每年有上百萬的新生兒死于早產相關的并發癥，早產是導致圍生兒患病和死亡的最常見原因[5]。目前已知的早產高危因素包括下生殖道感染、胎膜早破、子宮膨脹過度及妊娠合并癥等。然而，越來越多的研究表明，無論是否存在感染，炎癥反應在早產的發病中均起著至關重要的作用[2]。

早產是一個由免疫系統與神經系統、內分泌系統共同參與的過程。在此過程中，炎癥細胞包括中性粒細胞、巨噬細胞和其他淋巴細胞集聚在母胎界面，產生大量的細胞因子及趨化因子，進而募集更多的炎癥細胞并促使前列腺素和蛋白酶水平增高，引起子宮收縮、宮頸成熟擴張及胎膜早破[2]。

IL-17作為一種重要的炎性介質，主要由輔助性T細胞17(Th17)細胞、γδ T 細胞及自然殺傷 細胞等多種固有免疫細胞產生。IL-17能誘導多種炎癥細胞因子、急性期反應蛋白和趨化因子MCP-1、MIP-2等表達，促進嗜中性粒細胞的增殖、成熟和趨化，還能上調組織細胞黏附分子-1的表達，介導炎癥細胞和T 細胞在組織中的浸潤，并與其他炎癥細胞因子發揮協同效應，促進T 細胞的活化并協助B 細胞產生抗體，放大靶器官的免疫反應及炎癥性破壞，從而參與多種感染、自身免疫性疾病的發病[6-7]。

多項研究結果提示，IL-17在復發性流產的發生中起重要作用[8-10]。但其與早產的關系鮮見報道。Fu等[10]報道了IL-17在感染性早產中具有進一步誘導炎癥的作用，然而對其是否在激素誘導的早產中起作用筆者尚未見報道。故本研究選擇米非司酮誘導的早產大鼠模型，比較其與正常妊娠大鼠外周血中IL-17、GM-CSF的水平。結果發現，早產組大鼠在皮下注射米非司酮 24 h后血清IL-17的水平較6 h時升高；在注射后6 h時，早產組血清IL-17水平與對照組相近，24 h 時早產組血清IL-17水平高于對照組，而GM-CSF在2組間比較差異均無統計學意義。結果提示，炎癥因子IL-17可能參與促進了激素誘導的早產的發生，然而升高的IL-17主要由哪種細胞產生及其具體分子作用機制尚有待進一步的探討。本研究也從另一角度說明早產是多種因素(包括激素、炎癥因子等)相互作用的過程，而多學科人員的共同努力將為早產的防治提供新的思路及選擇。

[1]中華醫學會婦產科學分會產科學組. 早產臨床診斷與治療指南(2014).中華圍產醫學雜志，2015，18(4)：241-245.

[2]Romero R, Dey SK, Fisher SJ.Preterm labor: one syndrome, many causes.Science,2014,345(6198):760-765.

[3]Ito M, Nakashima A, Hidaka T, Okabe M, Bac ND, Ina S, Yoneda S, Shiozaki A, Sumi S, Tsuneyama K, Nikaido T, Saito S.A role for IL-17 in induction of an inflammation at the fetomaternal interface in preterm labour.J Reprod Immunol,2010,84(1):75-85.

[4]Garfield RE, Gasc JM, Baulieu EE.Effects of the antiprogesterone RU 486 on preterm birth in the rat.Am J Obstet Gynecol,1987,157(5):1281-1285.

[5]Howson CP, Kinney MV, McDougall L, Lawn JE; Born Too Soon Preterm Birth Action Group.Born too soon: preterm birth matters.Reprod Health,2013,10(Suppl 1):S1.

[6]Korn T, Bettelli E, Oukka M, Kuchroo VK.IL-17 and Th17 Cells.Annu Rev Immunol,2009,27:485-517.

[7]黃雪瓊，檀衛平，王東燁，麥賢弟，吳葆菁，李靜，藍丹. 哮喘患兒外周血RORC mRNA、IL-17水平及其與氣道重塑的關系研究.新醫學，2014，45(2):104-107.

[8]Nakashima A, Ito M, Shima T, Bac ND, Hidaka T, Saito S.Accumulation of IL-17-positive cells in decidua of inevitable abortion cases.Am J Reprod Immunol,2010,64(1):4-11.

[9]Wang WJ, Hao CF, Yi-Lin, Yin GJ, Bao SH, Qiu LH, Lin QD.Increased prevalence of T helper 17 (Th17) cells in peripheral blood and decidua in unexplained recurrentspontaneous abortion patients.J Reprod Immunol,2010,84(2):164-170.

[10]Fu B, Li X, Sun R, Tong X, Ling B, Tian Z, Wei H.Natural killer cells promote immune tolerance by regulating inflammatory TH17 cells at the humanmaternal-fetal interface.Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(3):E231-E240.

(本文編輯：林燕薇)

Expression and significance of interleukin-17 in the peripheral blood of mifepristone-induced preterm labor rat models

BaoJunjie,YeAihua,QiuXiantao,ShiShaoqing,LiuHuishu.

PretermBirthPreventionandTreatmentResearchUnit,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510623,China

Correspondingauthor,LiuHuishu

ObjectiveTo investigate the expression level and significance of interleukin (IL)-17 in the peripheral blood of mifepristone-induced preterm labor rat models. MethodsSpecific pathogen free (SPF)-grade Sprague-Dawley rats, aged 10-12 weeks, were acclimated for 1 week and then the male and female rats were housed and mated. A positive vaginal smear for sperm after mating was designated as gestation day 1 of pregnancy. Eight pregnant rats were randomly divided into control and preterm labor groups (n=4 for each group). In the preterm labor group, mifepristone-induced preterm labor rat models were established by subcutaneous injection of mifepristone at a dose of 10 mg/kg on gestation day 18 of pregnancy. In the control group, rats were injected with vehicle (sesame) on gestation day 18 of pregnancy. At 6 h and 24 h after injection, peripheral blood samples were collected for detection of the serum levels of IL-17 and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). The serum levels of IL-17 and GM-CSF were statistically compared between two groups. ResultsAfter subcutaneous injection of mifepristone on gestation day 18 of pregnancy, the time interval of labor onset in the preterm labor group was significantly shorter compared with that in the control group (P<0.01). At 6 h after administration of mifepristone, the IL-17 levels did not significantly differ between two groups (P>0.05). At 24 h after administration of mifepristone, the IL-17 level in the preterm labor group was significantly up-regulated than that in the control group(P<0.01). At 6- and 24-h after administration of mifepristone, the GM-CSF levels did not significantly differ between two groups(bothP>0.05). ConclusionThe IL-17 level in the peripheral blood of mifepristone-induced preterm labor rats was significantly up-regulated, suggesting that IL-17, as an inflammatory cytokine, probably participates in the incidence of hormone-induced preterm labor.

Mifepristone; Interleukin-17; Preterm labor; Rat

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.09.003

國家863計劃子課題項目(2011AA02A111)；廣州市醫藥衛生科技一般引導項目(20141A010028)

510623 廣州，廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心婦產科早產研究室(鮑俊杰，葉愛華，施少清，劉慧姝)，臨床檢驗部(邱先桃)

，劉慧姝

2016-06-05)