川芎嗪抗β淀粉樣蛋白25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡作用的機制

尹淑杰　柳朝陽　任永波　宋慶嬌　張　濤

(佳木斯大學，黑龍江　佳木斯　154007)

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川芎嗪抗β淀粉樣蛋白25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡作用的機制

尹淑杰1柳朝陽2任永波宋慶嬌張濤

(佳木斯大學，黑龍江佳木斯154007)

目的探討川芎嗪是否作用PI3K/Akt通路抗β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35誘導的細胞凋亡。方法Aβ25～35作用SH-SY5Y細胞建立AD細胞模型，MTT法檢測細胞的生存率，流式細胞術檢測細胞凋亡率；Western印跡檢測p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達。結果川芎嗪能夠抑制Aβ25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡和促進其存活；川芎嗪可抑制Aβ25～35引起的p-Akt/Akt、Bcl-2表達降低和Bax、caspase-3的表達增加。PI3K/Akt通路抑制劑LY294002能夠抑制川芎嗪對Aβ25～35誘導的細胞凋亡的保護作用，抑制川芎嗪誘導的p-Akt/Akt、Bcl-2表達上調及Bax、caspase-3表達下調。結論川芎嗪拮抗Aβ25～35誘導的細胞凋亡與作用PI3K/Akt通路，調節(jié)Bcl-2、Bax、caspase-3的表達有關。

川芎嗪；細胞凋亡；阿爾茨海默病；PI3K/Akt信號通路

川芎嗪(TMP)是中藥川芎根莖中的生物堿單體，具有抗凝、抑制血小板聚集、擴張血管、改善微循環(huán)等廣泛的生物作用。臨床上主要用于治療多種心血管疾病〔1，2〕。本實驗探討TMP抗β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35誘導的神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡是否與作用于PI3K/Akt通路有關。

1　材料與方法

1.1材料SH-SY5Y細胞株購于中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所細胞庫。 TMP純品、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑LY294002、Aβ25～35購于Sigma公司；膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光素(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3抗體、β-actin等抗體購于北京中杉金橋生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)SH-SY5Y細胞置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)，每2～3 d傳代1 次。取對數(shù)生長期的細胞進行藥物作用和檢測指標。

1.2.2阿爾茨海默病(AD)細胞模型的制備取對數(shù)生長期濃度為1×105/ml SH-SY5Y細胞2 ml接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。24 h后加入Aβ25～35繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞。

實驗分對照組、Aβ25～35組、TMP組(1 mmol/L)、LY組(LY294002濃度為50 μmol/L)、TMP+LY組。除對照組外，其余下四組Aβ25～35的濃度均為20 μmol/L。

1.2.3MTT法檢測細胞生存率胰酶消化對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，加入Aβ25～35及TMP，對照組加入等量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設空白對照(單純培養(yǎng)基、無細胞)組。加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl；培養(yǎng)4 h，每孔加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，于490 nm處檢測吸光度(OD)值。計算細胞存活率=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)。

1.2.4Annexin V-Fluos染色檢測細胞凋亡各組細胞胰酶消化，成懸液吹打，離心調節(jié)細胞濃度至1×105/ml，加入AimexinV-Fluos約100 μl/管，15℃避光15 min，用流式細胞儀檢測調亡(Ex=488 nm；Em=515 mn)，利用FCSExpress 3.0軟件分析細胞凋亡。

1.2.5Western印跡法檢測Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達收集各組細胞提取總蛋白，測定各組蛋白質含量。各組取等量蛋白上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進行凝膠電泳，并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜上。5%脫脂牛奶在4℃封閉 1 h，分別加入用封閉液稀釋的一抗Akt (1∶500)、p-Akt(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax (1∶500)、caspase-3 (1∶500)，β-actin(1∶2 000)，4℃孵育過夜，加入羊抗兔或抗鼠的第二抗體(1∶2 000)，室溫雜交1 h，采用增強化學發(fā)光法(ECL)檢測分析結果。對蛋白條帶灰度進行分析，以β-actin的灰度值為對照，計算各組蛋白相對表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS11.0軟件行LSD檢驗或單因素方差分析。

2　結　果

2.1TMP作用PI3K/Akt通路促進SH-SY5Y細胞存活SH-SY5Y細胞存活率：對照組〔(100.0±3.91)%〕高于Aβ25～35組〔(69.5±4.34)%〕(P<0.05 )；TMP組〔(92.8±2.32)%〕高于Aβ25～35組(P<0.05)；TMP+LY 組細胞存活率〔(81.5±2.09)%〕高于Aβ25～35組(P<0.05)低于TMP 組(P<0.05)，LY組〔(54.7±3.31)%〕低于Aβ25～35組和TMP+LY 組(P<0.05)。表明LY294002可以抑制TMP 促進Aβ25～35誘導的SH-SY5Y細胞存活的作用。

2.2TMP作用PI3K/Akt通路拮抗Aβ25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡SH-SY5Y細胞凋亡率檢測結果，LY組〔(52.1±3.76)%〕最高，對照組〔(4.1±0.03)%〕最低；TMP+LY組〔(31.5±3.11)%〕高于TMP組〔(7.3±0.17)%〕和Aβ25～35組〔(16.3±1.39)%〕(P<0.05)；TMP 組低于Aβ25～35組和TMP+LY組(P<0.05)。說明TMP能夠拮抗Aβ25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，抑制PI3K/Akt通路可以抑制TMP拮抗Aβ25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡作用。

2.3TMP對Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3表達的影響p-Akt/Akt 比值和Bcl-2表達：與Aβ25～35組相比，對照組最高(P<0.05)，LY組最低(P<0.05)，TMP組較高(P<0.05)；與TMP組相比，TMP+LY 組較低(P<0.05)；而TMP+LY組高于LY組(P<0.05)，表明TMP能夠促進p-Akt和Bcl-2的表達，PI3K/Akt抑制劑-LY294002能部分抑制TMP對p-Akt和Bcl-2表達的影響。Bax和caspase-3表達：與Aβ25～35組相比，TMP 組表達較低(P<0.05)；與TMP組相比，TMP+LY組表達較高(P<0.05)：而TMP+LY組的表達低于LY組和Aβ25～35組(P<0.05)。 說明TMP 能夠抑制Bax和caspase-3表達，P13K/Akt 抑制劑-LY294002 能夠部分抑制TMP對Bax和caspase-3表達的影響。見表1。

表1　Western印跡檢測 p-Akt/Akt、 Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達

與Aβ25～35組相比：1)P<0.05；與TMP組相比：2)P<0.05；與LY組相比：3)P<0.05

3　討　論

AD是一種神經(jīng)退行性疾病，以進行性認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。Aβ形成的老年斑和神經(jīng)元纖維纏結〔3〕及因細胞凋亡而導致廣泛的神經(jīng)元和突觸的丟失是AD病理特征。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中存在大量的神經(jīng)元凋亡和異常表達的凋亡相關蛋白酶〔4〕。

PI3K/Akt是在細胞生長增殖和代謝等方面發(fā)揮重要作用的信號通路〔5〕，與腫瘤、代謝疾病和神經(jīng)退行性疾病等均有關〔6〕。PI3K/Akt抑制細胞凋亡，一方面通過抑制Bcl-2家族蛋白和caspase蛋白實現(xiàn)，另一方面通過促進細胞存活的基因表達實現(xiàn)〔7〕。PI3K/Akt與AD密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中Akt的活性和含量明顯降低；Aβ25～35下調Akt的表達抑制激活PI3K/Akt信號通路〔8〕。Aβ25～35能通過抑制激活PI3K/Akt通路而誘導細胞凋亡〔9〕。因此，通過激活PI3K/Akt信號通路可以抑制神經(jīng)元凋亡。由此可見，在AD的發(fā)病機制中，信號通路PI3K/Akt具有重要作用，也是治療AD的有效靶點。

如果TMP可以激活信號通路PI3K/Akt來抑制 由Aβ25～35誘導的細胞凋亡，那么PI3K/Akt通路抑制劑就可以抑制TMP的抗 Aβ25～35誘導的細胞凋亡。本實驗結果表明TMP可以誘導Akt磷酸化，這個作用可被LY294002抑制，TMP具有激活PI3K/Akt信號通路作用。抗細胞凋亡通路PI3K/Akt具有調節(jié)Bcl-2、Bax、 caspase-3等表達的作用。我們推斷TMP主要作用PI3K/Akt通路上調Bcl-2的表達、下調caspase-3、Bax促凋亡蛋白的表達，抗Aβ25～35引起的細胞凋亡。因此抑制TMP抗Aβ25～35誘導的細胞凋亡可以通過抑制PI3K/Akt通路的激活實現(xiàn)。抑制信號通路PI3K/Akt可抑制TMP拮抗Aβ25～35誘導的細胞凋亡。

1李金柱，李偉.川芎嗪的結構改造及其生物活性研究進展〔J〕.中國實用醫(yī)藥，2008；3(1)：137-8.

2姜宏，施廣飛，朱珠.川芎嗪對心血管作用研究進展〔J〕.中國臨床藥理學與治療學，2007；12(5)：484-6.

3Ballard C，Gauthier S，Corbett A，etal.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2011；377(9770)：1019-31.

4Serrano-Pozo A，F(xiàn)rosch MP，Masliah E，etal.Neuropathological alterations in Alzheimer disease〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Med，2011；1(1)：a006189.

5Vadas O，Burke JE，Zhang X，etal.Structural basis for activation and inhibition of class I phosphoinositide 3-kinases〔J〕.Sci Signal，2011；4(195)：e2.

6Hemmings BA，Restuccia DF.PI3K-PKB/Akt pathway〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2012；4(9)：11189.

7Duronio V.The life of a cell；apoptosis regulation by the PI3K/PK Bpathway〔J〕.Biochem J，2008；415(3)：333-44.

8Lee HK，Kumar P，F(xiàn)u Q，etal.The insulin/Akt signaling pathway is targeted by intracellular beta-amyloid〔J〕.Mol Biol Cell，2009；20(5)：1533-44.

9Martin D，Salinas M，Lopez-Valdaliso R，etal.Effect of the Alzheimer amyloid fragment Abeta(25-35) on Akt/PKB kinase and survival of PC 12 cells〔J〕.J Neurochem，2001；78(5)：1000-8.

〔2015-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)

黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目(1252G059);黑龍江省自然科學基金資助項目(H2015074);佳木斯大學科技重點項目(Sz2011-009);黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(20050222026)

張濤(1971-)，女，博士，教授，碩士導師，主要從事中草藥抗腫瘤及腫瘤免疫機制方面的研究。

尹淑杰(1969-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、癲癇，頭痛眩暈及老年癡呆的診斷和治療。

R2-031

A

1005-9202(2016)17-4151-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.006

1濟寧市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內科

2佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)四科