聲敏劑5-氨基乙酰丙酸對器官組織及血液生化學指標的影響

王麗平　張振環　李茜楠　賈智博　孫　鑫　林　琳

(哈爾濱醫科大學,黑龍江　哈爾濱　150086)

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聲敏劑5-氨基乙酰丙酸對器官組織及血液生化學指標的影響

王麗平張振環李茜楠賈智博孫鑫林琳

(哈爾濱醫科大學,黑龍江哈爾濱150086)

目的探討聲敏劑5-氨基乙酰丙酸(ALA)對器官組織及血液生化學指標的影響。方法50只Wistar大鼠隨機分為5組，每組10只，A組按照30 mg/kg劑量給予股靜脈注射ALA溶液，B、C組按照60、120 mg/kg靜脈注射ALA溶液，D組靜脈注射ALA 120 mg/kg，避光2 h后，以2 W/cm2超聲強度超聲照射大鼠股動脈15 min，對照組股靜脈注射磷酸鹽緩沖液(PBS)1 ml。用藥后7 d各組大鼠采用腹腔注射超量戊巴比妥鈉的方法處死，取下腔靜脈血2 ml進行血生化檢測。取甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟進行病理學檢測。結果用藥后大鼠均自由活動，一般狀況可，毛色光澤，進食和排便正常，7 d內無死亡。用藥后7 d用藥組和對照組大鼠甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟組織切片光鏡下觀察均未發現有病理性改變；用藥后7 d各組大鼠血清總蛋白(TP)、谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和血糖(BS)測定結果均基本在正常參考范圍內，且各組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。結論大鼠應用聲敏劑ALA未引起重要臟器組織改變和血液生化各指標異常，可安全的用于聲動力治療(SDT)動脈粥樣硬化研究。

5-氨基乙酰丙酸；聲動力治療；動脈粥樣硬化

聲動力療法(SDT)是一種新出現的治療新生物或者非新生物疾病的方法，是通過超聲和聲敏劑的協同作用，對人體組織產生破壞作用，這種作用在醫學上可用于治療疾病，現已證明可對腫瘤細胞產生較強的殺傷作用，廣泛應用于腫瘤的治療〔1〕。動脈粥樣硬化(AS)斑塊對聲敏劑也有特異性的吸收作用。課題組前期工作已發現，在兔頸動脈AS模型中，使用5-氨基乙酰丙酸(ALA)為聲敏劑的SDT能明顯減小AS斑塊并使斑塊趨于穩定〔2〕。本實驗采用大鼠靜脈注射ALA并加上超聲照射方法，觀察ALA為聲敏劑的SDT的安全性。

1　材料與方法

1.1動物、藥品及儀器健康雄性Wistar大鼠50只，10周齡左右，體重200～250 g，購于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心。ALA購于Sigma公司，3%戊巴比妥鈉及利多卡因購于上海索萊寶生物科技有限公司，脈沖超聲治療儀購于深圳圣祥高科技有限公司，Olympus IX70顯微鏡購于日本Olympus公司，低溫高速離心機購于德國Biofuge公司，全自動生化分析儀Type AU2700購于日本Olympus公司。

1.2試劑及準備磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L)的配制：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.22 g，雙蒸水定容至1 L，細菌濾器過濾，4℃冰箱保存備用。ALA的配制：在避光條件下，將2.5 g ALA溶于100 ml PBS 溶液中，配制成25 mg/ml濃度備用，現用現配，避光保存。

1.3實驗方法50只大鼠隨機分為5組，每組10只，即A組、B組、C組、D組和對照組。A組按照30 mg/kg劑量給予股靜脈注射ALA溶液，B、C組按照60、120 mg/kg靜脈注射ALA溶液，D組靜脈注射ALA 120 mg/kg，避光2 h后，以2 W/cm2超聲強度超聲照射大鼠股動脈區域15 min，對照組股靜脈注射PBS 1 ml。具體方法：以3%戊巴比妥鈉(0.14 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，A、B組和C組大鼠仰臥固定于手術臺上，左側腹股溝區備皮，碘伏消毒，在腹股溝正中剪開皮膚約1 cm，分離脂肪，暴露股動脈和股靜脈，避光條件下直接向股靜脈內注藥，拔針后無菌紗布按壓止血，縫合傷口，5%利多卡因紗布敷于傷口周圍的皮膚，保溫，避光2 h，蘇醒后正常飼養。D組大鼠上述方法股靜脈注射ALA 120 mg/kg，避光2 h后，將兔仰臥位固定于手術臺上，右側腹股溝區備皮，將裝有冷氯化鈉溶液的自制水袋(4℃)置于兔腹股溝區股動脈搏動處，采用超聲輸出強度2 W/cm2進行照射，照射時間為15 min，超聲主要指標設定為：探頭傳感器0.87 MHz，直徑34 mm。對照組上述方法股靜脈注射PBS 1 ml，避光2 h，蘇醒后給予正常飼料喂養。用藥后7 d各組大鼠禁食12 h禁水6 h，采用腹腔注射超量戊巴比妥鈉(100 mg/kg)的方法處死動物，取各組大鼠下腔靜脈血2 ml進行血生化檢測。取甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟進行病理學檢測。

1.4指標檢測

1.4.1組織病理學分析各組動物臟器組織4%中性甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，進行連續性病理切片，常規HE染色，光鏡下觀察有無病理性改變。

1.4.2血清生化水平測定各組大鼠靜脈血2 ml，3 000 r/min離心5 min，分離血清，全自動生化分析儀測定血清總蛋白(TP)、谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和血糖(BG)。

1.5統計學方法應用SPSS13.0統計學分析軟件對數據的組間比較進行t檢驗。

2　結　果

2.1一般情況用藥后大鼠均自由活動，一般狀況可，毛色光澤，進食和排便正常，7 d內無死亡。

2.2臟器組織學觀察用藥后7 d用藥組和對照組各組大鼠甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟組織切片光鏡下觀察均未發現有病理性改變。

2.3血液生化指標測定用藥后7 d各組大鼠血清TP、ALT、AST、BUN、Cr和BS測定結果均基本在正常參考范圍內，且各組與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1　用藥后7 d各組大鼠血清生化指標測定值±s)

3　討　論

AS是脂質、碳水化合物、血液成分的灶狀沉積〔3〕，結締組織和鈣沉積所致的伴有動脈中層改變的聯合病變，它主要累及大中型肌彈力型動脈，以主動脈、冠狀動脈及腦動脈為多見，常導致慢性管腔閉塞或急性斑塊破裂誘發血栓形成和管壁破裂出血等嚴重后果，是危害人類健康最嚴重的心血管疾病〔4〕。目前AS的治療方式除了降低危險因素外，主要就是經皮介入治療和藥物涂層支架的使用，調脂治療以及抗血小板治療。非藥物治療主要包括經皮冠狀動脈介入治療(PCI)、動脈內膜切除術以及冠狀動脈旁路移植術(CABG)等。雖然這些技術一定程度上改善了患者的生活質量和預后，但是機械創傷大，并且出現了術后再狹窄(10%～20%)〔5，6〕及增加了支架內血栓的發生率(0.6%～3.1%)。另外對于血管彌漫性病變和分叉病變等效果較差。

SDT是一種新出現的治療新生物或者非新生物疾病的方法，是通過超聲和聲敏劑的協同作用，對人體組織產生破壞作用，這種作用在醫學上可用于治療疾病，現已證明可對腫瘤細胞產生較強的殺傷作用，廣泛應用于腫瘤的治療〔1〕。SDT充分利用聲波選擇性作用于病灶和聲敏劑選擇性蓄積的雙重選擇作用特異地殺傷細胞，對健康組織損害小、毒副反應少〔7〕。最早的聲敏劑是應用血卟啉或卟啉類衍生物等光敏劑，進一步研究中發現一些非卟啉類的化合物也有聲敏作用，如非甾體類抗炎藥、曙紅B、玫瑰紅等也有聲敏作用。聲敏劑 ALA是第二代光敏劑，與其他光敏劑相比，具有副作用小，用藥后避光時間短，滲透性好，對組織深層病變的療效和選擇性更佳等優點，成為目前光動力治療領域研究的方向和熱點〔8〕。ALA是一簡單的五碳化合物，多以鹽酸鹽形式存在，分子式為C5H9NO3·HCl。它是生物體的內源性物質，是動物血紅素和植物葉綠素生物合成的前體物質，在體內轉變為原卟啉Ⅸ(PpⅨ)在體內24 h 內被清除〔9〕。PpⅨ是血紅素內源性合成代謝途徑中的一種前體。PpⅨ是一種非常有效的光敏劑，它在一定波長的光照射下，發生化學反應，產生單重態氧和氧化物，引起細胞膜、線粒體和核酸的損傷，使病變細胞壞死、凋亡，從而起到治療疾病的作用〔10〕。現在研究發現，PpIX也具有聲敏劑的特性。目前亦開始用于聲動力治療。

聲敏劑常靜脈注射，也可局部給藥。新生物組織對聲敏劑優勢攝取，并較長時間滯留其內〔11〕。聲敏劑被動脈粥樣斑塊選擇性攝取的機制可能為：其與血清白蛋白和脂蛋白尤其是低密度脂蛋白相結合，由于AS斑塊中含有大量巨噬細胞、平滑肌細胞，有大量的低密度脂蛋白受體，因此，聲敏劑通過低密度脂蛋白受體介導可較多聚集在斑塊的細胞內〔12〕。

由于SDT 具有相對小的毒副作用，且具有無創的優點，SDT 一經提出立刻受到全世界學者的高度重視。Umemura等〔13〕通過生物體內和體外的實驗研究表明，在血卟啉存在條件下，超聲與血卟啉共同作用誘導腫瘤細胞壞死比無血卟啉時明顯增多，由此提出了聲動力治療的概念。Koh等〔14〕研究了聲動力治療用于兔股動脈置入支架后再狹窄預防作用，本課題組前期工作中，我們發現在兔模型中，聲敏劑ALA 為60 mg/kg濃度時SDT通過誘導巨噬細胞凋亡，減少脂質積聚和增加血管平滑肌細胞以及膠原的含量發揮了減輕AS和穩定斑塊的作用〔2〕。本研究結果說明ALA 120 mg/kg給藥結合超聲照射的實驗方法也是安全的。以ALA為聲敏劑的聲動力治療是安全的，為下一步聲動力治療AS研究提供了有效保障。

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13Umemura S，Yumita N，Nishigaki R，etal.Sonochemical activation of hematoporphyrin：a potential modility for cancer treatment〔C〕.Proc of 1989 IEEE Ultrasonic Symp，1989：955-60.

14Koh A，Kousukue H，Hiroyuki K，etal.Sonodynamic therapy decreased neointimal hyperplasia after stenting in the rabbit iliac artery〔J〕.Circulation，2002；105：149-51.

〔2015-03-17修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

黑龍江省衛生廳科研資助項目(2010-073)

賈智博(1975-)，男，副主任醫師，博士，主要從事心肌梗死后細胞移植研究。

王麗平(1976-)，女，副主任醫師，博士，主要從事冠心病防治研究。

R543.5

A

1005-9202(2016)17-4155-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.008