白細(xì)胞介素-18對(duì)分泌性中耳炎大鼠耳腔灌洗液中干擾素-γ和白細(xì)胞介素-4表達(dá)的影響

曲　莉

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院耳鼻喉二病區(qū)，河南　南陽(yáng)　473000)

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白細(xì)胞介素-18對(duì)分泌性中耳炎大鼠耳腔灌洗液中干擾素-γ和白細(xì)胞介素-4表達(dá)的影響

曲莉

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院耳鼻喉二病區(qū)，河南南陽(yáng)473000)

目的探討白細(xì)胞介素(IL)-18對(duì)分泌性中耳炎(OME)大鼠耳腔灌洗液中干擾素(IFN)-γ和IL-4表達(dá)的影響。方法選取30只成年雄性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、OME模型組(模型組)和IL-18處理組(觀察組)，各10只。參照Hardy的方法對(duì)模型、觀察組大鼠腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏后耳內(nèi)激發(fā)制成OME模型，對(duì)照組大鼠于相同時(shí)間點(diǎn)分別腹腔注射氫氧化鋁溶液及磷酸鹽緩沖液(PBS)。同時(shí)觀察組于第1、2、7、8、15、16天腹腔注射IL-18溶液(1 μg溶于0.2 ml生理鹽水)，對(duì)照、模型組同期腹腔注射0.2 ml生理鹽水。第18天于耳鏡下觀察鼓膜像表現(xiàn)，光鏡下觀察中耳組織的病理學(xué)改變，ELISA法測(cè)定大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的水平。結(jié)果(1)模型、觀察組中耳內(nèi)呈現(xiàn)炎癥反應(yīng)，觀察組炎癥較模型組有所減輕；(2)三組嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，模型組三種細(xì)胞數(shù)均多于對(duì)照組，觀察組嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組，中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)多于模型組(P<0.05)，其他兩兩比較無(wú)差異(P>0.05)；(3)模型、觀察組大鼠的IFN-γ與IL-4水平均顯著高于對(duì)照組，且觀察組的IFN-γ水平高于模型組(P<0.05)，而模型、觀察組IL-4水平無(wú)差異(P>0.05)，模型組的Th1/Th2比值顯著低于對(duì)照、觀察組(P<0.05)，對(duì)照、觀察組無(wú)差異(P>0.05)。結(jié)論IFN-γ和IL-4共同參與OME的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，IL-18可通過(guò)上調(diào)IFN-γ和IL-4的表達(dá)，調(diào)控Th1/Th2的平衡狀態(tài)而抑制OME的進(jìn)展。

分泌性中耳炎；白細(xì)胞介素18；干擾素γ；白細(xì)胞介素4

分泌性中耳炎(OME)是中耳非化膿性炎性疾病，病因是咽鼓管的機(jī)械性阻塞和功能障礙〔1〕。Th2/Th1細(xì)胞失衡是造成OME發(fā)生的重要因素〔2〕。白細(xì)胞介素(IL)-4和干擾素(IFN)-γ作為T(mén)h2和Th1分泌的細(xì)胞因子，在OME發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。IL-18可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生和T細(xì)胞增殖〔3〕，改善OME患者中耳Th2/Th1細(xì)胞失衡狀態(tài)。本研究旨在探討IL-18對(duì)OME的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物選取30只SPF級(jí)成年雄性SD大鼠(購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量250～300 g，均由耳窺鏡檢查證實(shí)無(wú)外耳道及中耳感染。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫(21.0±3.0)℃，濕度50%～75%，自然光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.1.2主要儀器與試劑(1)儀器：酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)；電子顯微鏡(日本OLYMPUS)(2)試劑：卵清蛋白(OVA，Ⅴ級(jí)，美國(guó)Sigma公司)；IL-18(美國(guó)R&D公司)ELISA試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)

1.2研究方法

1.2.1動(dòng)物分組與OME模型制備采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、OME模型組和IL-18處理組(觀察組)，每組10只。參照Hardy等〔4〕的方法制備OME模型，取1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，再取5.14 mg氫氧化鋁溶于0.6 ml PBS作為免疫佐劑，震蕩均勻，行腹腔注射，第8天行第二次注射，造成全身致敏；于第15天用10%的水合氯醛以15 mg/kg體重的劑量麻醉大鼠，將0.1 mg OVA溶于35 μl PBS中，以微量進(jìn)樣器于手術(shù)顯微鏡下由鼓膜注入，第16天麻醉后觀察耳內(nèi)鏡下的鼓膜情況，并注射第2次，形成耳內(nèi)激發(fā)狀態(tài)，此時(shí)OME模型制備完成。模型制備成功表現(xiàn)為鼓膜呈明顯內(nèi)陷、紅斑，部分可見(jiàn)液平面及中耳內(nèi)氣泡。對(duì)照組大鼠處理方法：取5.14 mg氫氧化鋁溶于1.2 ml PBS中，于全身致敏階段注入腹腔，并于耳內(nèi)激發(fā)階段注入等量PBS。

1.2.2處理方法〔3〕觀察組進(jìn)行OME造模同時(shí)于第1、2、7、8、15、16天腹腔注射IL-18(取1 μg溶于0.2 ml生理鹽水)，對(duì)照、模型組同期腹腔注射0.2 ml生理鹽水。

第18天時(shí)麻醉大鼠，于耳鏡下觀察鼓膜像表現(xiàn)，斷頭處死，將雙側(cè)中耳腔以50 μl PBS液進(jìn)行3次灌洗，收集150 μl灌洗液，于4℃ 離心機(jī)中以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清液置于-80℃冰箱中保存。取雙側(cè)中耳組織固定于4%的多聚甲醛中，脫鈣、脫水，行常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1大鼠中耳黏膜組織病理學(xué)改變常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察中耳及咽鼓管的病理變化，隨機(jī)選擇細(xì)胞數(shù)多的5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞。

1.3.2灌洗液中IFN-γ和IL-4的表達(dá)采用ELISA試劑盒測(cè)定三組大鼠中耳灌洗液中的IFN-γ和IL-4水平。首先以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，后采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光度值，計(jì)算其濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS14.0軟件，三組正態(tài)分布計(jì)量資料行單因素方差分析，兩兩均數(shù)的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1耳鏡下大鼠鼓膜像的改變對(duì)照組鼓膜像大致正常，呈現(xiàn)少量放射狀血管紋；模型、觀察組大鼠耳膜及周?chē)M織均可見(jiàn)充血，及放射狀擴(kuò)張的血管紋，出現(xiàn)明顯內(nèi)陷及紅斑，部分標(biāo)本可見(jiàn)液平面及氣泡，觀察組鼓膜鏡像較模型組炎癥程度有所減輕。

2.2大鼠中耳黏膜組織病理學(xué)改變對(duì)照組大鼠中耳內(nèi)組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)，纖毛上皮呈輕度腫脹，纖毛結(jié)構(gòu)正常且排列整齊；模型、觀察組耳黏膜明顯增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張，纖毛上皮明顯腫脹且排列紊亂，部分纖毛脫落，黏膜下層及骨髓腔中可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，咽鼓管周?chē)蚀蠹?xì)胞明顯增多；觀察組炎癥表現(xiàn)較模型組有所減輕。模型組三種細(xì)胞數(shù)均多于對(duì)照組，觀察組嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組，中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)多于模型組(P<0.05)，其他兩兩比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3三組大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的表達(dá)模型、觀察組IFN-γ與IL-4水平均顯著高于對(duì)照組，且觀察組的IFN-γ水平高于模型組(P均<0.05)，而模型、觀察組IL-4水平比較無(wú)差異(P>0.05)；模型組的Th1/Th2比值顯著低于對(duì)照、觀察組(P<0.05)，而對(duì)照、觀察組比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1　三組大鼠中耳組織切片細(xì)胞計(jì)數(shù)比較±s)

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05

表2　三組大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的表達(dá)

3　討　論

“Th2/Th1失衡假說(shuō)”認(rèn)為，正常機(jī)體內(nèi)Th1、Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，共同維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)，若平衡失調(diào)，機(jī)體將啟動(dòng)一系列免疫病理反應(yīng)，產(chǎn)生疾病〔5〕。Th1和Th2為CD4+T輔助細(xì)胞在抗原等刺激作用下產(chǎn)生的兩種亞群的效應(yīng)細(xì)胞，均來(lái)自一個(gè)共同的前體細(xì)胞Th0，二者在免疫系統(tǒng)中功能各異。其中Th1細(xì)胞主要增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫，其分泌的IFN-γ是巨噬細(xì)胞活化必不可少的細(xì)胞因子；Th2細(xì)胞分泌IL-3、IL-4等大量細(xì)胞因子，且誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞合成高水平的抗原特異性IgE，主要參與第1型自體免疫疾病，在IgE和嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔6〕，兩者共同作用與調(diào)控維持機(jī)體的正常免疫狀態(tài)。而一旦二者比例失衡，將造成機(jī)體的免疫紊亂狀態(tài)，有研究發(fā)現(xiàn)，Th2/Th1失衡與鼻炎、變應(yīng)性哮喘、宮頸癌等疾病的發(fā)生有關(guān)〔7～9〕。其與OME的相關(guān)關(guān)系亦受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，劉華等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)，中耳在各種刺激下可造成Th細(xì)胞分化偏移，發(fā)生Th2反應(yīng)，造成粘膜上皮損傷，黏液分泌增加，中耳滲液增加及調(diào)節(jié)功能下降。因此，如何上調(diào)Th1反應(yīng)及抑制Th2反應(yīng)成為糾正OME的關(guān)鍵。IL-18為一種由巨噬細(xì)胞分泌的多效能的免疫調(diào)節(jié)因子，有研究表明其對(duì)先天性免疫及Th1/Th2免疫反應(yīng)具有調(diào)控作用〔10〕，其對(duì)OME的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制仍待深入探討。本研究結(jié)果表明Th1和Th2細(xì)胞參與大鼠OME的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，大鼠中耳組織在外源性刺激下，IFN-γ和IL-4表達(dá)增多，大量激活Th1和Th2細(xì)胞的分泌，介導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而使嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞增多。與以往研究結(jié)果〔3〕相符。此外，IL-18可抑制OME的持續(xù)進(jìn)展，說(shuō)明其作用機(jī)制可能為：IL-18可單獨(dú)產(chǎn)生或通過(guò)與IL-12、IL-2的協(xié)同作用誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，上調(diào)Th1反應(yīng)，同時(shí)IL-18通過(guò)持續(xù)激活Th2細(xì)胞，維持IL-4的過(guò)量分泌，從而發(fā)揮Th1/Th2免疫反應(yīng)的雙重調(diào)節(jié)作用，共同作用使Th1/Th2比值上調(diào)，從而調(diào)控OME的進(jìn)展。而另外也有研究指出IL-18可使自然殺傷(NK)細(xì)胞的毒性顯著增強(qiáng)〔11〕，影響FasL/Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致OME大鼠的免疫功能紊亂和OME的持續(xù)存在，這可能是IL-18對(duì)OME的另一種作用機(jī)制，對(duì)其具體作用方式和調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

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〔2015-12-31修回〕

(編輯袁左鳴)

曲莉(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻喉疾病方面的研究。

R76

A

1005-9202(2016)17-4176-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.018