丙酸睪酮與5-羥色胺對老年大鼠脊髓腰骶段年齡相關還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽性體表達的影響

宋　宇　董明巖

(錦州醫科大學附屬第一醫院骨外科脊柱病區，遼寧　錦州　121000)

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丙酸睪酮與5-羥色胺對老年大鼠脊髓腰骶段年齡相關還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽性體表達的影響

宋宇董明巖

(錦州醫科大學附屬第一醫院骨外科脊柱病區，遼寧錦州121000)

目的探討丙酸睪酮與5-羥色胺對老年大鼠脊髓腰骶段年齡相關還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽性體(ANB)表達的影響。方法選擇無特定病原體級的SD大鼠進行析因設計：即LC 組(6 月齡，無干預對照)；LT 組(6 月齡，丙酸睪酮干預)；LS組〔6 月齡，5-羥色胺(HT)干預〕；MC組(21 月齡，無干預對照)；MT組(21月齡，丙酸睪酮干預)；MS 組(21 月齡，5-HT干預)；HC組(24 月齡，無干預對照)；HT組(24 月齡，丙酸睪酮干預)；HS 組(24月齡，5-HT干預)，每組8只。干預后，取大鼠脊髓腰骶段，觀察ANB和一氧化氮合酶(NOS)的表達。結果ANB和NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背側部，隨著大鼠的衰老，ANB的表達逐漸增多。丙酸睪酮干預組ANB表達要明顯少于對照組。5-HT干預組ANB表達與無干預對照組無明顯變化。隨著大鼠的衰老，NOS的表達逐漸增少。丙酸睪酮干預組NOS表達要明顯多于對照組，5-HT干預組NOS表達與無干預對照組無明顯變化。各組脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈負相關。結論脊髓腰骶段ANB的出現與衰老有關，隨著機體的老化ANB的表達逐漸增多。脊髓腰骶段ANB的出現可能與體內衰老過程中睪酮的減少存在一定的關系，補充丙酸睪酮可以減少衰老過程中ANB的出現；而補充5-HT則未見類似效果。

丙酸睪酮；5-羥色胺；脊髓腰骶段；年齡相關還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽性體(ANB)

腰骶段脊髓對于調控人體的盆底肌發揮非常重要的作用〔1,2〕。隨著人體衰老，腰骶段脊髓會呈現與機體年齡相關的退行性變化，伴發生殖器官、直腸和膀胱的功能衰退。一氧化氮(NO)是神經系統中發揮關鍵作用的信息物質〔3～5〕，其與眾多生理活動相關聯。老年患者盆腔臟器的生理功能異常與腰骶段脊髓NO及一氧化氮合酶(NOS)的表達有密切關系。衰老過程中腰骶段脊髓會出現與衰老程度相關的還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽性體(ANB)的表達上調〔6〕。而且，隨著衰老，老年男性患者愈來愈經常出現泌尿功能障礙。參與調節人體排尿反射的神經中樞在腰骶段脊髓，故而推測腰骶段脊髓中ANB的表達能夠影響人體排尿反射。此外，隨著衰老，患者體內的雄激素——睪酮含量會逐漸降低〔7～9〕，腰骶段脊髓5-羥色胺(HT)在泌尿反射中發揮重要作用〔10〕。本文探討丙酸睪酮與5-HT對老年大鼠脊髓腰骶段ANP表達影響的分子生物學機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物選擇無特定病原體級(SPF)SD大鼠，在實驗大鼠繁育到第6個月時選用，體重275～300 g，由遼寧醫學院的動物實驗部提供(合格批準文號：動012)。標準的大鼠飼料(鼠糧由動物中心提供)喂養，自由攝食與飲水。本實驗方案經遼寧醫學院的倫理審查委員會的審查批準，并且全部操作按照動物實驗相關的經典指南來嚴格地執行。

1.2分組LC組(6月齡，無干預對照)；LT組(6月齡，丙酸睪酮干預)；LS組(6月齡，5-HT干預)；MC組(21月齡，無干預對照)；MT組(21月齡，丙酸睪酮干預)；MS 組(21月齡，5-HT干預)；HC組(24月齡，無干預對照)；HT組(24月齡，丙酸睪酮干預)；HS 組(24 月齡，5-HT干預)。每組8只。

1.3儀器與試劑色譜級純品L-谷氨酸(美國Sigma公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.4干預措施無干預對照：通過背部皮下注射芝麻油作為安慰劑，給藥劑量為2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，連續3個月；丙酸睪酮干預：通過背部皮下注射睪酮制劑，給藥劑量為2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，連續3個月；5-HT干預：通過背部皮下注射5-HT，給藥劑量2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，連續3個月。

1.5觀察指標〔4〕脊髓腰骶段ANB、NOS的表達情況。

1.6取材干預結束后，取材前8 h禁食，但同時不禁水，尾靜脈注射1.5 g/kg 20%麻醉劑脲乙烷麻醉后，使用自制的大鼠專用的斷頭臺迅速斷頭取出腰骶段脊髓組織；在去除二乙基焦炭酸鹽的冰面之上，充分吸去腰骶段脊髓組織的血跡。稱重，加1 ml甲醇-水配制的離心液，低溫下勻漿處理，繼而取出一部分的勻漿液置于4℃ ，以12 000 r/min進行15 min的離心處理，最后取出上清液，再經濾膜的過濾處理之后，將其放置在-80℃冰箱保存待測。

1.7色譜法檢測神經遞質谷氨酸的海馬內濃度①將取材完畢的大鼠的海馬組織置于勻漿器之內勻漿處置取其上清液備用。②選用測試所需的標準品和輔助實驗試劑，包括鄰苯二甲醛和色譜級甲醇。③調試色譜系統至工作狀態，選用低溫型高速離心機和色譜測試系統及色譜測量分析工作站。④調整色譜測試條件，即將色譜測試柱的溫度調節為35℃，設定A流動相為0.1 mol/L醋酸鉀，設定B流動相為色譜級甲醇。第五步驟實施洗脫程序(二元的梯度洗脫)，采用標準的二元的梯度洗脫程序。⑤測試所需蛋白(色譜測試過程中用作標準液)，選用Eppendorf 3810型微量離心管，在測試離心管中加入待測的樣品本溶液100 μl(提前調定好濃度)和衍生試劑100 μl(已經調定好濃度)，反應持續2 min，再次加入已經調定好濃度的樣品本溶液20 μl。⑥繪制測試蛋白的標準曲線，測定待測樣本的含量。

1.8統計學處理采用SPSS19.0軟件行χ2檢驗和方差分析。

2　結　果

2.1各組脊髓腰骶段ANB的含量ANB主要分布在大鼠脊髓腰骶段背側部，并且隨著大鼠的衰老，ANB的表達逐漸增多(P<0.05)。各丙酸睪酮干預組ANB表達要少于對照組(P<0.05)。5-HT干預組ANB表達較無干預對照組無明顯變化(P>0.05)(表1)。

2.2各組脊髓腰骶段NOS的含量NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背側部，并且隨著大鼠的衰老，NOS的表達逐漸增少(P<0.05)。各丙酸睪酮干預組NOS表達要多于對照組(P<0.05)。5-HT干預組NOS表達較無干預對照組無明顯變化(P>0.05)(表2)。

表1　各組脊髓腰骶段ANB含量

1)與無干預對照組比較：P<0.05，2)主效應；3)交互效應；下表同

表2　各組脊髓腰骶段NOS含量

2.3各組脊髓腰骶段ANB和NOS含量相關性LC、LT、LS、MC、MT、MS、HC、HT、HS組脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈負相關(r=-0.96、-0.95、-0.85、-0.90、-0.89、-0.97、-0.96、-0.91、-0.88，均P<0.05)。

3　討　論

雄激素在保持機體的肌肉量和機體代謝方面具有重要功能。本研究結果提示ANB表達量的增多與隨年齡增長導致睪酮的減少有密切關系。本文中高齡大鼠腰骶段脊髓的ANB的表達量亦有下降的趨勢，但其下降幅度較小，其原因可能是在補充丙酸睪酮時老年大鼠脊髓腰骶段已經表達了較多的ANB，此時難以完全緩解這一趨勢。NO在外周和中樞神經系統中具有重要的信號轉導作用。NOS是NO生成的關鍵酶，在NO發揮的眾多生理與病理作用的過程中，起著非常重要的調節作用，因此經常通過檢測NOS活性來間接反映NO的含量〔11,12〕。本文結果提示，5-HT可能沒有深切參與控制排尿的神經回路或者泌尿道神經活動。

1Rejc E,Angeli C,Harkema S,etal.Effects of lumbosacral spinal cord epidural stimulation for standing after chronic complete paralysis in humans 〔J〕.PLoS One,2015;10(7):e0133998.

2Hofstoetter US,Danner SM,Freundl B,etal.Periodic modulation of repetitively elicited monosynaptic reflexes of the human lumbosacral spinal cord 〔J〕.J Neurophysiol,2015;114(1):400-10.

3Oku H,Morishita S,Horie T,etal.Nitric oxide increases the expression of aquaporin-4 protein in rat optic nerve astrocytes through the cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G pathway 〔J〕.Ophthalmic Res,2015;54(4):212-21.

4Stojanovic M,Scepanovic L,Hrncic D,etal.Multidisciplinary approach to nitric oxide signaling:focus on the gastrointestinal and the central nervous system 〔J〕.Vojnosanit Pregl,2015;72(7):619-24.

5宋曉晶，張棟，馬慧敏，等.電針對小鼠肝組織內ET-1、NO含量的影響〔J〕.中華中醫藥雜志,2011;26(9):1978-81.

6周晨明.老年大鼠脊髓腰骶段 ANB 表達及相關特性〔D〕.石家莊：河北醫科大學,2012.

7Hoyos CM,Yee BJ,Phillips CL,etal.Body compositional and cardiometabolic effects of testosterone therapy in obese men with severe obstructive sleep apnea:a randomized placebo-controlled trial 〔J〕.Eur J Endocrinol,2015;173(5):167531-41.

8Malan NT,Smith W,von K?nel R,etal.Low serum testosterone and increased diastolic ocular perfusion pressure:a risk for retinal microvasculature 〔J〕.Vasa,2015;44(6):435-43.

9Shiota M,Takeuchi A,Sugimoto M,etal.Low serum testosterone but not obesity predicts high gleason score at biopsy diagnosed as prostate cancer in patients with serum PSA lower than 20 ng/ml 〔J〕.Anticancer Res,2015;35(11):6137-45.

10Noga BR,Johnson DM,Riesgo MI,etal.Locomotor-activated neurons of the cat.Ⅰ.Serotonergic innervation and colocalization of 5-HT7,5-HT2A,and 5-HT1A receptors in the thoraco-lumbar spinal cord 〔J〕.J Neurophysiol,2009;102(3):1560-76.

11Pereira-Suárez AL,Alvarado-Navarro A,Barrietos-GarcIa JG,etal.Differential expression of solute carrier family 11a member 1 and inducible nitric oxide synthase 2 in skin biopsies from leprosy patients 〔J〕.Indian J Dermatol Venereol Leprol,2015；81(6):594-9.

12Saito Y,Fujii Y,Yashiro M,etal.Inhibitory effects of edaravone,a free radical scavenger,on cytokine-induced hyperpermeability of human pulmonary microvascular endothelial cells:a comparison with dexamethasone and nitric oxide synthase inhibitor 〔J〕.Acta Med Okayama,2015;69(5):279-90.

〔2015-01-19修回〕

(編輯杜娟)

董明巖(1963-)，男，碩士，主任醫師，主要從事骨脊柱疾病研究。

宋宇(1989-)，男，在讀碩士，主要從事脊柱退行性變研究。

R744.6

A

1005-9202(2016)17-4178-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.019