復方普洱茶飲料對動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊的干預作用及血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平的影響

任　攀　康群甫　劉衛紅　周明學

(首都醫科大學附屬北京中醫醫院　北京市中醫研究所，北京　100010)

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·基礎研究·

復方普洱茶飲料對動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊的干預作用及血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平的影響

任攀康群甫劉衛紅周明學

(首都醫科大學附屬北京中醫醫院北京市中醫研究所，北京100010)

目的探討復方普洱茶飲料對高脂喂養的ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化(As)斑塊的干預作用及血清血栓素(TX)A2/前列環素(PG)I2比值和DNA甲基化水平的影響。方法將30只8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養6 w后隨機分為模型組、立普妥(陽性對照組)和茶飲料組(n=10)，給予藥物干預6 w，另設正常組同品系小鼠(C57BL/6J家系)6只。檢測其血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、胰島素、TXA2、PGI2、DNA甲基化轉移酶(DNMT)水平和DNA甲基化水平。HE染色和VG染色，圖像分析測量小鼠主動脈As斑塊面積、斑塊內細胞外脂質成分和膠原成分。結果與模型組相比，茶飲料組和立普妥組小鼠血清TC和TG水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高(均P<0.01),校正后主動脈As斑塊面積、斑塊內細胞外脂質成分顯著降低(P<0.05)；小鼠血清DNA甲基化、DNMT及胰島素水平、小鼠血清TXA2水平顯著降低而血清PGI2水平顯著升高(均P<0.01)。結論復方普洱茶飲料可以降低血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平，從而達到抗ApoE-/-小鼠主動脈As斑塊的作用。

動脈粥樣硬化；胰島素抵抗；血脂異常；茶飲料；DNA甲基化

由于人們生活水平的提高及生活方式的改變，高糖、高脂飲食攝入量增加，導致體內脂質代謝紊亂以及胰島素抵抗，使動脈粥樣硬化(As)的患病風險明顯上升〔1〕，而臨床上As患者常伴有血小板聚集狀態異常。新近研究表明，DNA甲基化是導致As和胰島素抵抗發生發展的重要機制。既往研究表明普洱茶具有減肥、降脂和抗As的作用〔2～5〕。本實驗以高脂喂養的ApoE-/-小鼠為觀察對象，探討復方普洱茶飲料對脂質代謝異常、胰島素抵抗和血小板凝集異常等的影響。

1　材料與方法

1.1實驗試劑血清膽固醇檢測試劑盒(批號110821)、血清甘油三酯檢測試劑盒(批號110541)、血清低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(批號120531)、血清高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(批號120501)，均購自中生北控生物科技股份有限公司。血清DNA甲基化轉移酶檢測試劑盒(R&D公司，CK-E433652M，美國)、VG染色試劑盒(福州市邁新生物技術開發公司，批號：1312178002)。小鼠血清胰島素檢測試劑盒(R&D公司，CK-E20353M，美國)、血清前列環素檢測試劑盒(R&D公司，CK-E10062M，美國)，血清血栓素A2檢測試劑盒(R&D公司，CK-E11438M，美國)。

1.2實驗藥物按重量計，普洱茶20～30份，山楂20～30份，白菊花10～20份，陳皮10～20份，烏梅10～20份，各味飲片均由首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房提供。按10 g/100 ml的比例加入自來水，浸泡1 h；一煎煎出藥液100～150 ml，二煎煎出藥液70～100 ml；將兩次所煎藥液混勻，加入普洱茶，加熱浸泡10 min，然后將普洱茶濾出，將藥液濃縮至(67±5)ml，倒入100 ml試劑瓶中，密封4℃冰箱保存，注明熬制日期備用。阿托伐他汀鈣，商品名立普妥，上海輝瑞制藥公司，批號H20051408。

1.3動物及分組6～8周齡ApoE-/-小鼠30只，品系C57BL/6J，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。高脂飼養6 w后，所有小鼠隨機分為模型組、立普妥組(陽性對照組)3 mg/kg、茶飲料組405.5 mg/kg，每組10只。另設正常組同品系小鼠6只。所有給藥組劑量根據成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，并按成人與小鼠的給藥劑量換算系數折算成小鼠用量灌胃給藥，每日1次，灌胃給藥6 w。模型組給予等量的生理鹽水。高脂飼料配方為脂肪21%(wt/wt)、膽固醇0.15%的西方類型膳食飼料。喂養12 w。各組動物在喂養12 w后頸椎脫臼法處死，眶下靜脈叢取血，保留血清，無菌條件下取心臟，4%多聚甲醛固定。

1.4血清生化指標檢測及動脈粥樣硬化指數采用氧化酶法和直接法檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。采用ELISA法檢測血清胰島素水平、血清TXA2、PGI2和DNA甲基化轉移酶(DNMT)水平。采用高效液相色譜法(HPLC)檢測血清DNA甲基化水平。

1.5組織病理采用HE病理染色和IPP圖像軟件分析測量小鼠主動脈As斑塊面積：測量管腔面積(LA,mm2)、內彈力膜圍繞面積(IELa,mm2)，并計算斑塊面積、校正后斑塊面積。斑塊面積(PA,mm2)= IELa-LA。校正后斑塊面積 = PA/IELa；采用IPP圖片分析軟件測量小鼠主動脈斑塊內脂質成分面積。校正后斑塊內脂質面積 =斑塊內脂質成分面積(LA,mm2)/PA(mm2)。采用VG染色和IPP圖像軟件分析主動脈As斑塊內膠原成分。校正后斑塊內膠原面積 =斑塊內膠原成分面積

(CA,mm2)/PA(mm2)。

1.6動脈粥樣硬化指數(AI)AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.7統計學方法應用SPSS11.5軟件。計量資料組間比較在方差齊時用方差分析，兩兩比較用t檢驗。

2　結　果

2.1小鼠主動脈As模型的復制高脂喂養12 w后，ApoE-/-小鼠主動脈出現典型的As斑塊，與正常組同品系C57小鼠相比，高脂飼料喂養12 w后的ApoE-/-小鼠(模型組)主動脈管壁上可觀察到典型的富含膽固醇酯的As斑塊(圖1)，斑塊有成熟的纖維帽覆蓋。說明復制As模型成功。

圖1　高脂喂養的ApoE-/-小鼠主動脈與正常同品系小鼠主動脈病理形態對比(HE，×200)

2.2茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠血清血脂水平和AI的影響采血后室溫放置1 h，3 500 r/min離心15 min后，血液分層。模型組小鼠上清液呈白色乳糜狀，立普妥組小鼠上清液與模型組比較略清澈，而茶飲料組小鼠血清更清澈。與模型組相比，茶飲料組和立普妥組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平明顯降低，小鼠血清HDL-C水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，茶飲料組和立普妥組小鼠AI均顯著降低(P<0.01)；兩給藥組之間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1　茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠血清血脂水平和AI的影響

與模型組比較：1)P<0.01；下表同

2.3茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠校正后主動脈As斑塊面積的影響藥物干預6 w后，與模型組〔(38.63±10.39)mm2〕相比，立普妥組〔(19.04±8.88)mm2〕和茶飲料組〔(18.28±12.85)mm2〕小鼠的校正后主動脈As斑塊面積顯著降低(P<0.05)，兩給藥組之間無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

2.4茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內細胞外脂質成分的影響藥物干預6 w后，與模型組〔(78.84±8.22)%〕相比，立普妥組〔(38.86±10.94)%〕和茶飲料組〔(21.68±4.59)%〕的校正后主動脈As斑塊內細胞外脂質成分顯著降低(P<0.01)，兩給藥組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.5茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內膠原成分的影響藥物干預6 w后，與模型組〔(45.12±6.67)%〕相比，立普妥組〔(13.60±8.57)%〕和茶飲料組〔(16.34±12.88)%〕的校正后主動脈As斑塊膠原成分顯著降低(P<0.01)，兩給藥組之間無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖2　茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的影響(×100)

圖3　茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內膠原成分的影響(×100)

2.6茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠血清DNA甲基化水平和DNMT水平的影響藥物干預6 w后，與模型組〔(18.20±0.519 3)μmol/L,(88.44±3.308)U/L〕相比，立普妥組〔(13.40±0.952 4)μmol/L,(57.82±6.072)U/L〕和茶飲料組〔(8.518±0.391 8)μmol/L,(26.72±2.497)U/L〕小鼠血清DNA甲基化水平及DNMT水平顯著降低(P<0.01)，兩給藥組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.7茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠體重的影響與模型組相比〔(33.88±1.85)g〕，茶飲料組小鼠體重明顯降低〔(29.17±1.98)g〕(P<0.01)，并且優于立普妥組〔(32.56±1.32)g〕(P<0.05)。

2.8茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠血清胰島素水平的影響藥物干預6 w后，與模型組〔(20.75±0.470 4)mIU/L〕相比，立普妥組〔(18.29±0.622 4)mIU/L〕和茶飲料組〔(18.37±0.286 2)mIU/L〕小鼠血清胰島素水平明顯降低(P<0.01)，兩給藥組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.9茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠血清TXA2、PGI2和TXA2/PGI2比值的影響藥物干預6 w后，與模型組相比，立普妥組和茶飲料組小鼠血清TXA2水平顯著降低，而血清PGI2水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，立普妥組和茶飲料組小鼠血清TXA2/PGI2比值顯著降低，兩給藥組之間無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　茶飲料對高脂喂養12 w ApoE-/-小鼠血清TXA2、PGI2 和TXA2/PGI2比值的影響

3　討　論

胰島素抵抗作為As獨立危險因素，可引起脂質代謝異常和炎癥反應〔6〕,是連接多種代謝性疾病的中心環節〔7〕。臨床上As患者常伴有血小板聚集狀態異常。新近研究表明，DNA甲基化是導致As和胰島素抵抗發生的重要機制。既往研究表明普洱茶具有減肥、降脂和抗As的作用〔2～5〕。本實驗發現復方普洱茶飲料可明顯減輕As小鼠體重和降低血清胰島素水平，并可通過調脂、改善血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平起到抗As的作用。

本研究中選用普洱茶、山楂、白菊花、陳皮和烏梅5種常見的茶飲食材。普洱茶溫和，具有暖胃、減肥、降脂的作用，其中的茶褐素可以減少內臟脂肪的積累〔8〕。山楂具有開胃消食、活血化瘀之功效，其提取物中的山楂總黃酮對不同動物的高脂模型均有肯定的降脂作用，還可減少血小板在血管壁的聚集和血栓素的釋放；另外山楂還具有強心、降血壓的作用，適用于As和冠心病患者〔9〕。白菊花性涼，味甘苦，具有疏風清熱、明目解毒的功效，可調整血脂。陳皮理氣開胃、燥濕化痰、可減肥降脂，陳皮中類黃酮和陳皮多糖具有顯著的降糖〔10〕、抗血小板聚集的作用〔11〕。烏梅斂肺、澀腸、生津、安蛔，可改善血脂和血壓。本實驗結果表明復方普洱茶飲料具有調脂、抗As以及潛在的改善胰島素抵抗和穩定As斑塊的作用，而改善胰島素抵抗可能是中心環節。

PGI2主要由血管內皮細胞和平滑肌細胞產生，具有舒張血管和抑制血小板聚集的作用。TXA2主要由血小板微粒合成和釋放，其作用與PGI2相反，具有收縮血管和促進血小板聚集的作用。TXA2/PGI2 之間的動態平衡是調控血管壁緊張度、血小板功能及血管壁細胞遷移生長的重要因素，PGI2/TXA2 平衡失調易導致血小板聚集、血栓形成。本研究結果提示復方普洱茶飲料在改善胰島素抵抗發揮抗As作用的同時還可能具有預防血栓形成的作用。

新近研究表明，DNA甲基化是導致As和胰島素抵抗發生發展的重要機制。Kim等〔12〕研究發現基因組甲基化水平與冠心病及冠心病風險呈正相關，而DNA甲基化程度的改變可導致胰島素抵抗〔3〕。本研究結果提示，復方普洱茶飲料可能通過調節小鼠血清的整體DNA甲基化水平和DNMT水平影響其基因的甲基化水平，從而發揮改善胰島素抵抗和抗As的作用。

本研究結果表明，復方普洱茶飲料能夠抑制ApoE-/-小鼠As斑塊的形成和進展，其機制可能是通過調節血脂，降低血清DNA甲基化水平和TXA2/PGI2比值等發揮抗As的作用。本實驗中所用的藥材均采用常用食材，沒有毒副作用和不良反應，值得進一步研發。

1馬芳義，魏芳晶.胰島素抵抗與動脈粥樣硬化的關系研究進展〔J〕.醫學綜述,2010;16(14):2112-4.

2Sharma P,Garg G,Kumar A,etal.Genome wide DNA methylation profiling for epigenetic alteration in coronary artery disease patients〔J〕.Gene,2014;541(1):31-40.

3Ling C,Del Guerra S，Lupi R，etal.Epigenetic regulation of PPARGC1A in human type 2 diabetic islets and effect on insulin secretion〔J〕.Diabetologia,2008;51(4):615-22.

4程春華,楊繼紅.普洱茶對apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(15):3241-3.

5徐湘婷,王鵬,羅紹忠,等.普洱茶預防SD大鼠高脂血癥及抗氧化、保護血管內皮的研究〔J〕.云南農業大學學報(自然科學版),2011;26(2):260-4.

6沈燕,黎紅華.胰島素抵抗導致動脈粥樣硬化的機制研究〔J〕.神經損傷與功能重建,2012;7(5):377-9.

7DeFronzo RA.Insulin resistance,lipotoxicity,type 2 diabetes and atherosclerosis:the missing links.The Claude Bernard Lecture 2009〔J〕.Diabetologia,2010;53(7):1270-87.

8鄒曉菊,丁毅弘,梁斌.普洱茶減肥、降脂機制的探討〔J〕.動物學研究,2012;33(4):421-6.

9吳士杰，李秋津，肖學風，等.山楂化學成分及藥理作用的研究〔J〕.藥物評價研究，2010;33(4):316-8.

10趙秀玲.陳皮生理活性成分研究進展〔J〕.食品工業科技,2013;34(12):376-81.

11吉中強,宋魯卿,牛其昌.15種理氣中藥體外對人血小板聚集的影響〔J〕.中草藥,2001;32(5):46-8.

12Kim M,Long TI,Arakawa K,etal.DNA methylationasa biomarker for cardiovascular disease risk〔J〕.PLoS One,2010;5(3):e9692.

〔2016-06-30修回〕

(編輯曲莉)

Effects of compound Pu-erh Tea beverage on aorta atheromatous plaque and the levels of PGI2/TXA2 and DNA methylation in serum on atherosclerosis mice

REN Pan,KANG Qun-Fu,LIU Wei-Hong,et al.

Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University,Beijing institute of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100010,China

ObjectiveTo explore the effects of compound Pu-erh Tea beverage on aorta atheromatous plaque and on the levels of PGI2/TXA2 and DNA methylation in serum of atherosclerosis model mice.Methods30 male mice lacking ApoE gene were treated with high-fat diet for 7 weeks and then randomly divided into model,lipitor (Positive control group),Pu-erh Tea groups(n=10). Then the mice were treated with drugs for another 6 weeks. Moreover,6 C57BL/6J mice were as normal control. The levels of serum TC,TG,LDL-C,HDL-C,insulin,thromboxane A2(TXA2),prostacyclin I2 (PGI2),DNA methyltransferase (DNMT) and the DNA methylation were tested.ResultsCompared with those of model group,the levels of serum TC and TG were significantly reduced in Pu-erh Tea and lipitor groups,and the level of HDL-C was significantly increased (P<0.01),after adjustment,the area of aortic As plaque,the extracellular lipid composition were decreased significantly(P<0.05). The level of serum DNA methylation,DNMT,insulin,TXA2 were significantly decreased and PGI2 was significantly increased(P<0.01).ConclusionsCompound Pu-erh Tea beverage could significantly decrease the levels of TXA2/PGI2,DNA methylation,which maybe have an preventing effect on atherosclerosis ApoE-/-mice

Atherosclerosis;Insulin resistance;Dyslipidemia;Tea beverage;DNA methylation

國家自然科學基金課題(81303086)；北京市科技新星計劃課題(Z131107000413026)；北京市衛生系統高層次衛生技術人才項目(2014-3-100)

周明學(1978-)，男，博士，主要從事動脈粥樣硬化的機制和中醫藥防治研究。

任攀(1990-)，男，碩士，主要從事心血管疾病中西醫結合基礎研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)15-3609-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.001