人參糖肽對大鼠胰島β細胞損傷的改善作用

趙麗艷　李相軍　張秀云　苗春生　李　才　劉昕鳴

(吉林大學第二醫院檢驗科，吉林　長春　130041)

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人參糖肽對大鼠胰島β細胞損傷的改善作用

趙麗艷李相軍1張秀云1苗春生1李才1劉昕鳴

(吉林大學第二醫院檢驗科，吉林長春130041)

目的探討人參糖肽對鏈脲佐菌素(STZ)引起大鼠胰島β細胞損傷的改善和防護作用。方法腹腔注射STZ損傷雄性Wistar大鼠胰島為胰島損傷組；注射STZ前連續7 d腹腔注射人參糖肽保護胰島為人參糖肽組；以不經任何處理的大鼠為對照組。實驗結束時采用放射免疫分析法檢測大鼠血清胰島素和C肽含量，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察胰島病理改變，免疫組織化學染色檢測胰島素蛋白表達水平，電鏡觀察胰島細胞超微結構變化。結果與對照組相比，胰島損傷組大鼠血清胰島素和C肽含量顯著降低(P<0.01)，而人參糖肽組的血清胰島素和C肽含量較胰島損傷組明顯升高(P<0.01)。HE染色觀察顯示胰島損傷組胰島細胞數量顯著減少，細胞排列不整，細胞腫脹，結構破壞，人參糖肽組的胰島細胞損傷明顯改善。免疫組織化學研究顯示，胰島損傷組胰島素陽性染色面積明顯縮小，而人參糖肽組的胰島素陽性染色面積明顯擴大(P<0.01)。胰島損傷組胰島β細胞超微結構為變性-壞死性改變且分泌顆粒極少，而人參糖肽組胰島β細胞變性-壞死性改變明顯改善，分泌顆粒顯著增多。結論人參糖肽能明顯改善STZ引起的大鼠胰島β細胞損傷。

人參糖肽；胰島β細胞；血清胰島素；超微結構

人參糖肽是人參中的一種成分，其注射液是國家級治療糖尿病的中藥二類新藥，以往的研究證明，人參糖肽能明顯降低實驗性高血糖動物的血糖水平〔1,2〕。在臨床上用人參糖肽治療2型糖尿(T2DM)患者后血糖水平明顯降低〔3〕，停藥4 w后血糖仍維持在較低水平〔4〕，但人參糖肽對血糖影響的機制尚不明確。胰島β細胞的重要功能是分泌胰島素，對機體糖代謝發揮重要影響，在糖尿病的發生發展中起關鍵作用。目前人參糖肽對胰島β細胞的影響尚未見研究，本研究旨在探討人參糖肽對鏈脲佐菌素(STZ)所致大鼠胰島β細胞損傷的改善效果。

1　材料與方法

1.1材料人參糖肽注射液由吉林省松原天實藥業有限責任公司提供，使用時用生理鹽水配成所需濃度。STZ、胰島素抗體購自Sigma公司。胰島素和C肽放射免疫分析試劑盒購自中國原子能科學研究院同位素研究所；其他試劑為國產分析純。濃縮型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒及其他組化試劑購自博士德公司。體重200～250 g雄性Wistar大鼠由吉林大學實驗動物部提供(實驗動物合格證號：吉科字950000010，醫動字10-5110)。

1.2動物分組和處理用生理鹽水將人參糖肽配成所需濃度，取8只大鼠按400 mg/kg體重腹腔注射人參糖肽，1次/d，連續7 d為人參糖肽組。取8只大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，末次注射后1 h，按60 mg/kg體重腹腔注射STZ胰島損傷組。注射STZ或生理鹽水后24 h腹主動脈穿刺取空腹血液，分離血清，安樂死法處死大鼠取胰腺供形態學研究。取不經任何處理的8只大鼠作為對照組。血清胰島素和C肽含量按放射免疫分析試劑盒說明書測定。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學染色胰腺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，沿胰腺團塊長軸連續切片，以2 mm間隔制備4 μm切片6張，HE染色，顯微鏡下觀察胰島形態。胰島素免疫組化染色：石蠟切片脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，1%H2O2室溫孵育5 min，抗原修復液修復，山羊血清封閉后滴加胰島素一抗(1∶200)，4℃過夜，以PBS代替一抗作為陰性對照。PBS漂洗，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗，加入SABC 37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹脂封片，光鏡觀察反應產物呈棕褐色為陽性反應。利用Imagepro Plus 6.0分析軟件測定胰島素陽性染色的面積和胰島面積，計算胰島素陽性染色的面積占胰島面積的百分比，表示胰島素蛋白表達水平。

1.4胰島細胞電鏡觀察取小塊胰腺組織在含2.5%戊二醛固定液中細切成1 mm3小塊，用4%戊二醛前固定和1%鋨酸后固定，Epon 812包埋，制備半薄切片，顯微鏡下定位胰島后，用LKB-V型超薄切片機制備超薄切片，鈾和鉛雙重染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察胰島超微結構并攝片。

1.5統計學分析采用SPSS12.0 軟件進行單因素方差分析、χ2檢驗。

2　結　果

2.1三組血清胰島素、C肽含量比較與對照組相比，胰島損傷組大鼠血清胰島素、C肽含量顯著降低(P<0.01)，而人參糖肽組較胰島損傷組均明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1　血清胰島素和C肽含量

與對照組比較:1)P<0.01，與胰島損傷組比較:2)P<0.01

2.2HE染色觀察胰島病理變化對照組：胰腺組織中每個視野可見4～6個胰島，胰島呈橢圓形，胰島內可見較多胰島細胞，細胞排列整齊，核呈圓形，染色質均勻，無濃染細胞；胰島損傷組：胰島數量減少，分布稀疏，胰島細胞數量顯著減少，細胞排列不整齊，大部分細胞腫脹，胞質著色淺，空泡增多，可見嗜伊紅細胞，核呈多邊形，染色質分布不均勻；人參糖肽組：每個視野可見2～4個胰島，胰島細胞排列比較規整，核多為橢圓形，染色質較豐富均勻，少數細胞質呈嗜伊紅改變。見圖1。

2.3免疫組化染色觀察胰島素表達胰島β細胞胰島素陽性表達于胞質，呈棕黃色。對照組：胰島細胞分布規整，胰島內可見大量染成濃重棕黃色的β細胞，胰島素陽性染色面積百分比〔(89.9±24.2)%〕增大。胰島損傷組：胰島細胞腫脹，排列不規整，數量明顯減少，僅見少數染成淺淡黃色的β細胞，胰島素陽性染色面積〔(38.8±8.2)%〕明顯縮小。人參糖肽組：與胰島損傷組相比，胰島內細胞數明顯增多，細胞排列較規整，胰島素陽性染色面積百分比〔(76.4±18.6)%〕明顯增大，著色增強。

圖1　各組大鼠胰島HE、免疫組化染色和β細胞超微結構

2.4胰島β細胞超微結構改變對照組：細胞核規則，核膜光滑，染色質均勻分布，胞質內可見大量含有致密芯的分泌顆粒。胰島損傷組：呈變性、壞死性改變，胞核不規則，核膜皺褶、內陷，染色質濃集、邊聚，線粒體腫脹，嵴溶解，胞質內可見較多大小不一的空泡，分泌顆粒極少。人參糖肽組：胞核較規則，染色質均勻分布，線粒體較多，胞質內可見一些空泡，分泌顆粒增多。見圖1。

3　討　論

人參糖肽為人參中天然降血糖成分，臨床應用證明，人參糖肽具有降低糖尿病患者血糖的作用，但尚未闡明這種作用是否與保護胰島β細胞功能有關。胰島β細胞功能受損是決定血糖水平變化最為重要的因素，也是導致糖尿病發生的重要病理生理機制。評價β細胞功能對了解糖尿病的發生、發展甚至預測糖尿病的預后非常重要。胰島素由胰島β細胞分泌，是體內唯一可降低血糖的激素，測定血胰島素含量可反映胰島β細胞的功能。以往研究表明，人參中抗糖尿病作用的有效成分主要有人參皂苷、人參多肽和人參多糖等〔5〕，但其降糖作用與胰島β細胞功能關系的研究很少。有研究證明，北美人參根的提取物能降低糖尿病小鼠血漿胰島素和C肽水平〔6〕。C肽是胰島β細胞的分泌產物，與胰島素等分子共同釋放，C肽穩定好，不受外源性胰島素和血胰島素抗體的影響，已成為判斷胰島素分泌能力的一個良好指標〔7〕。本研究結果表明，人參糖肽對胰島β細胞損傷具有較好的防護作用。

目前臨床上評估胰島β細胞功能的方法有10多種，但這些方法各有優缺點，尚不能精準反映胰島β細胞功能質和量的動態變化均需進一步完善〔8,9〕。形態學能更直觀顯示胰島β細胞結構的定位改變，本研究表明人參糖肽處理可修復受損的β細胞，使胰島素蛋白表達水平增加。Lim等〔10〕研究顯示,口服高麗參提取物可降低環孢素引起的小鼠血糖水平，改善糖耐量，提高血清胰島素含量，增加胰島β細胞面積，證明高麗參對環孢素所致胰島β細胞損傷有防護作用。而且本研究結果為人參糖肽能明顯減輕胰島β細胞損傷提供了有力的形態學證據。

1Wang BX,Zhou QL,Yang M,etal.Hypoglycemic activity of ginseng glycopeptides〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2003;24(1):50-4.

2陳文學,楊銘,于德偉,等.人參糖肽對糖尿病氣陰兩虛證大鼠降血糖作用及其機制研究〔J〕.中國藥學雜志,2014;49(21):1903-7.

3葛煥琦,蔡寒青,王濤,等.人參糖肽注射液治療2型糖尿病30例〔J〕.吉林大學學報(醫學版),2003;29(2):206-7.

4張秋梅,張喆,于德民,等.人參糖肽治療2型糖尿病的臨床觀察〔J〕.中國現代醫學雜志,2003;13(6):59-62.

5王麗杰,王春艷,張冬燕,等.人參治療糖尿病及作用機制研究進展〔J〕.中國熱帶醫學,2013;13(7):906-9.

6Sen S,Querques MA,Chakrabarti S.North American Ginseng(Panax quinquefolius)prevents hyperglycemia and associated pancreatic abnormalities in diabetes〔J〕.J Med Food,2013;16(7):587-92.

7Di Nardo F,Cogo CE,Faelli E,etal.C-Peptide-based assessment of insulin secretion in the Zucker fatty rat:a modelistic study〔J〕.PLoS One,2015;10(5):e0125252.

8Cersosimo E,Solis-Herrera C,Trautmann ME,etal.Assessment of pancreatic β-cell function:review of methods and clinical applications〔J〕.Curr Diabetes Rev,2014;10(1):2-42.

9陳晨,徐向進,陳頻.胰島β細胞功能評估〔J〕.醫學綜述,2014;20(9):1561-4.

10Lim SW,Doh KC,Jin L,etal.Oral administration of ginseng ameliorates cyclosporine-induced pancreatic injury in an experimental mouse model〔J〕.PLoS One,2013;8(8):e72685.

〔2015-10-14修回〕

(編輯滕欣航)

吉林省科學技術廳資助項目(20010545)

劉昕鳴(1961-)，女，副教授，主要從事內分泌代謝疾病臨床生化研究。

趙麗艷(1971-)，女，博士，副教授，主要從事代謝性疾病和抗病生物學研究。

R587.1;R965

A

1005-9202(2016)15-3638-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.012

1吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室