AKT-mTOR信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中的意義

張麗勇

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生理教研室，吉林　白城　137000)

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AKT-mTOR信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中的意義

張麗勇

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生理教研室，吉林白城137000)

目的探討AKT-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中的表達(dá)情況。方法取清潔級SD大鼠12只，分離并培養(yǎng)椎間盤軟骨終板細(xì)胞，建立體外自然傳代退變模型。隨機分為空白對照組(自然傳代第2代細(xì)胞)，自然退變組(自然傳代第5代細(xì)胞)、AKT-mTOR信號通路抑制組(含LY294002抑制劑培養(yǎng)基傳代至第5代)，AKT-mTOR信號通路激動組(含IGF-1激動劑培養(yǎng)基傳代至第5代)。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)；甲苯胺藍(lán)染色檢測細(xì)胞蛋白聚糖變化；RT-PCR檢測細(xì)胞中Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9以及AKT-mTOR信號通路中關(guān)鍵基因mTOR的表達(dá)情況；Western印跡檢測AKT、p-AKT蛋白表達(dá)情況。結(jié)果隨著傳代次數(shù)增加，大鼠軟骨終板細(xì)胞的表現(xiàn)逐漸減少。自然退變組Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表達(dá)水平均明顯低于空白對照組(P<0.05)，AKT-mTOR信號通路抑制組表達(dá)水平明顯低于自然退變組(P<0.05)；AKT-mTOR信號通路激動組表達(dá)水平明顯高于自然退變組(P<0.05)。四組的AKT蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；抑制組p-AKT蛋白表達(dá)水平低于另外3組，而激動組p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于抑制組和自然退變組(P<0.05)。結(jié)論AKT-mTOR信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞自然退變中具有重要作用，添加AKT-mTOR信號通路抑制劑、激動劑能夠加速、抑制細(xì)胞體外退變的發(fā)生。

椎間盤退行性改變；軟骨細(xì)胞；AKT/mTOR

椎間盤退變是脊柱退行性疾病發(fā)生的起因和病理基礎(chǔ)。軟骨終板是椎間盤主要供養(yǎng)途徑，是維持椎間盤正常形態(tài)和生理功能的關(guān)鍵〔1〕。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的一種，其所處的信號通路包括上游的P13K、AKT、PTEN、TSC1/2，以及下游的SK6、4EBP。而信號通路中P13K、AKT突變可引發(fā)mTOR通路的高度激活〔2〕。相關(guān)研究顯示，mTOR作為P13K相關(guān)激酶之一，在控制細(xì)胞生長周期方面具有重要作用〔3〕。本研究旨在探明AKT-mTOR信號通路與大鼠軟骨終板細(xì)胞退變的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1動物和試劑清潔級SD大鼠12只，4～5周齡，雌雄各半，體重140～180 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。膠原酶、胰蛋白酶(北京中生瑞泰科技有限公司)；LY294002 AKT信號通路抑制劑(美國SIGMA公司)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；PCR試劑盒及相關(guān)抗體(北京天根生化科技有限公司)；IGF-1 rat recombinant(上海浩然生物技術(shù)有限公司)；AKT、p-AKT(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分組斷髓處死12只大鼠，75%乙醇溶液中浸泡20 min，無菌操作臺內(nèi)取完整腰椎，逐個剝離大鼠腰椎間盤1～5段終板軟骨，胰蛋白酶消化分離軟骨終板細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞單層融合度85%～90%時開始細(xì)胞傳代，傳至第2代后終止，2×105個/孔接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，連續(xù)培養(yǎng)2～3 d。其中第2代細(xì)胞為空白對照組；第2～5代細(xì)胞為自然傳代組；細(xì)胞傳代過程中添加30 μmol/ml的含LY294002 AKT信號通路抑制劑的細(xì)胞培養(yǎng)液，傳代至第5代為AKT-mTOR信號通路抑制組；細(xì)胞傳代過程中添加20 ng/ml的含IGF-1 AKT信號通路激動劑的細(xì)胞培養(yǎng)液，傳代至第5代為AKT-mTOR信號通路激動組。

1.2.2甲苯胺藍(lán)染色各組中細(xì)胞融合約80%時進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色：除去細(xì)胞培養(yǎng)液后用磷酸緩沖液(PBS)沖洗3～4次，4%多聚甲醛固定45 min后除去固定液，用PBS沖3～4次，甲苯胺藍(lán)染色60 min，PBS洗凈后放于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3RT-PCR檢測使用Trizol抽提各組軟骨終板細(xì)胞的RNA，Agilent 2100 bioanalyzer檢測提取RNA的純度，取1 μg總RNA，一步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR擴增體系為10 μl(SYBRR染料預(yù)混的extaq 酶5 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，cDNA模板4 μl)，引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。混勻后常規(guī)反應(yīng)條件下置于RT-PCR儀中反應(yīng)。

1.2.4Western印跡檢測吸除6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS沖3～4次，每孔加入100 μl含PMSF的蛋白裂解液，冰袋上裂解40 min，4℃ 12 000 r/min離心20 min，吸取上清液至無菌EP管中，BCA法測定提取得到的蛋白質(zhì)濃度。每組取蛋白質(zhì)樣品20 μg，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜120 min。5% BSA封閉60～120 min，加一抗(1∶1 000)，4℃過夜，TBST沖洗3次，加二抗(1∶5 000)，溫室孵育3 h，TBST沖洗3次。紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描并收集數(shù)據(jù)，GAPDH為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1大鼠軟骨終板表型變化隨著傳代次數(shù)增加，大鼠軟骨終板細(xì)胞逐漸表現(xiàn)出梭形變化，出現(xiàn)多角形和觸角，第2～5代呈現(xiàn)出纖維化趨勢，見圖A1～A4。大鼠軟骨終板細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色顯示，第2～5代染色逐漸變深、深染，見圖B1～B4。空白對照組、自然退變組和第5代激動劑組的軟骨終板細(xì)胞形態(tài)、甲苯胺藍(lán)染色顯示：第5代激動劑組細(xì)胞形態(tài)和染色與自然退變組相比恢復(fù)明顯，但未恢復(fù)到空白對照組形態(tài)，見圖2。

A1～A4為自然傳代第2～5代細(xì)胞形態(tài)；B1～B4為自然傳代第2～5代甲苯胺藍(lán)染色圖1　大鼠軟骨終板細(xì)胞形態(tài)和甲苯胺藍(lán)染色(×100)

圖2　自然傳代第2代、自然傳代第5代、第5代激動劑組細(xì)胞形態(tài)和甲苯胺藍(lán)染色(×100)

2.2大鼠軟骨終板相關(guān)基因RT-PCR檢測自然傳代組中：第2～5代大鼠中Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表達(dá)明顯降低；抑制組的表達(dá)明顯低于自然傳代組(P<0.05)；激動劑組表達(dá)明顯高于自然傳代組(P<0.05)。

2.3大鼠軟骨終板細(xì)胞中AKT及p-AKT表達(dá)變化Western印跡檢測顯示，空白對照組、自然退變組、AKT-mTOR信號通路抑制組和激動組的AKT蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。抑制組p-AKT蛋白表達(dá)水平低于另外3組，而激動組p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于抑制組和自然退變組(P<0.05)，見圖3。

圖3　Western印跡檢測大鼠軟骨終板細(xì)胞的AKT水平

3　討　論

PI3K-AKT-mTOR信號通路在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，可影響細(xì)胞的增殖、分化PI3K是一種分布于細(xì)胞質(zhì)中的復(fù)合體，作為脂類激酶能夠催化磷脂酰肌醇D3位的酸化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的整個周期以及能量轉(zhuǎn)運等〔4〕。相關(guān)研究顯示，胰島素樣生長因子、表皮樣生長因子等多種信號傳導(dǎo)復(fù)合體和生長因子均可啟動PI3K-AKT信號通路的激活過程〔5〕。而PI3K-AKT信號通路在細(xì)胞增殖、分化、代謝中發(fā)揮重要作用。人類和鼠類在mTOR結(jié)構(gòu)的氨基酸分子水平上的同源性高達(dá)95%〔6〕，mTOR不僅有控制基因翻譯、參與DNA/RNA合成、影響蛋白質(zhì)降解等生理過程，最新研究還發(fā)現(xiàn)其與哺乳動物生理性衰老及腫瘤發(fā)生具有明顯關(guān)聯(lián)〔7〕。mTOR信號通路不僅是細(xì)胞正常生長周期的調(diào)控中心，還是PI3K-AKT信號通路控制細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點。mTOR位于PI3K-AKT信號通路的下游，能夠調(diào)控翻譯過程中的啟動及延伸、氨基酸轉(zhuǎn)運、機體代謝相關(guān)蛋白酶的轉(zhuǎn)錄、核糖體合成。

相關(guān)研究顯示，AKT-mTOR信號通路與人體一系列退行性病變存在明顯相關(guān)性〔8〕。LY294002是目前常用的AKT-mTOR信號通路抑制劑，能夠抑制該通路的磷酸化而使其喪失活性，影響下游mTOR信號，進(jìn)而抑制細(xì)胞分化、增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IGF-1是目前常用的AKT-mTOR信號通路激動劑，能夠明顯加快關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、分化，以及軟骨基質(zhì)合成，能夠有效削弱LY294002對細(xì)胞的抑制效果。本研究結(jié)果顯示，AKT-mTOR信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞體外自然退變過程中起到重要作用，在軟骨終板細(xì)胞傳代過程中調(diào)控AKT-mTOR信號通路可有效加速、緩解甚至抑制大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞的生理性退變。本次實驗結(jié)果為抑制腰椎間盤生理性退變提供了一個全新思路和靶點，可以此為基礎(chǔ)研發(fā)相關(guān)治療藥物。

1鐘小明，胡偵明，沈皆亮，等.白藜蘆醇干預(yù)對已退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(6)：1304-7.

2Wang K，Chen YP，Lei Y，etal.Electrochemical method for monitoring the progress of polymerase chain reactions using Methylene blue as an indicator〔J〕.Mikrochimica Acta，2013；180(9/10)：871-8.

3Urquiza MP，Acatzi Silva AI.Copy number ratios determined by two digital polymerase chain reaction systems in genetically modified grains〔J〕.Metrologia，2014；51(1)：61-6.

4徐宏光，彭紅心，程加峰，等.人頸椎椎體終板軟骨細(xì)胞退變模型的建立及其意義〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2011；91(41)：2912-6.

5Wang C，Zhou H，Zhu W，etal.Ultrasensitive electrochemical DNA detection based on dual amplification of circular strand-displacement polymerase reaction and hybridization chain reaction〔J〕.Biosensors Bioelectronics，2013；47：324-8.

6Deng M，Wang Y，Li J,etal.N-Methylimidazolium modified magnetic particles-assisted highly sensitive Escherichia coli detection based on polymerase chain reaction and capillary electrophoresis〔J〕.Anal Chim Acta，2014；827：47-53.

7鐘小明.白藜蘆醇通過SIRT1/IGF-1R/AKT通路促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)〔D〕.重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2012.

8王飛.腰椎間盤退變中軟骨終板細(xì)胞的凋亡及CTGF對其保護(hù)作用的實驗研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2010.

〔2016-02-15修回〕

(編輯滕欣航)

吉林省教育廳“十二五”項目(20140129)

張麗勇(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事臨床生理學(xué)研究。

R68

A

1005-9202(2016)15-3651-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.018