血清miR-21檢測在慢性腎臟病并發心血管病變中的意義

洪麗萍，劉變玲，沈蓓莉，肖愛華

1.鄭州頤和醫院腎內科，河南鄭州450000；2.鄭州人民醫院腎內科，河南鄭州　450000

血清miR-21檢測在慢性腎臟病并發心血管病變中的意義

洪麗萍1，劉變玲2，沈蓓莉2，肖愛華1

1.鄭州頤和醫院腎內科，河南鄭州450000；2.鄭州人民醫院腎內科，河南鄭州450000

目的探討血清microRNA-21（miR-21）檢測在慢性腎臟病（CKD）并發心血管病變中的意義。方法收集2014年4月—2015年12月來該院就診或進行例行健康檢查的150例CKD患者血清標本，其中以20名健康體檢者作為對照。采用實時熒光定量PCR檢測血清miR-21表達水平。結果20名健康體檢者血清中均檢測到miR-21，CKD患者不同分期（1、2、3、4、5期）的血清miR-21檢出率分別為53.3%（16/30）、43.3%（13/30）、30%（9/30）、20%（6/30）和6.66%（2/30）。CKD患者隨著腎小球濾過率（GFR）值的降低，miR-21的檢出率逐漸降低，CKD各分期的miR-21表達水平差異無統計學意義，miR-21表達量與cTnI濃度的相關性差異有統計學意義（r=-0.292，P= 0.0009）。結論CKD患者常伴隨有不同程度的心血管病變，miR-21可作為CKD患者心血管病變的早期預警標志。

慢性腎臟病；心血管病變；miR-21

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）往往伴隨著不同程度的心血管病變，死于心血管病變的CKD患者占CKD總死亡人數的44%～51%，嚴重影響患者長期生存［1］。CKD并發心血管病變的患者治療效果差，預后不良，其危險性正在被人們廣泛關注，目前對于該類疾病的治療主要采取早期預測和早期干預的方式。MicroRNA（miRNA）是近年來備受關注的一類小分子，研究發現miRNA在各種疾病和生理過程中均發揮重要作用［2］。此外，miRNA也被作為一種新興的生物學標志物用來預測各類疾病的發生發展。最近研究表明miR-21可作為糖尿病腎病的分子診斷標志物［3］，該文通過檢測2014年4月—2015年12月來該院進行例行健康檢查或就診的20例健康對照組和150例不同分期CKD患者血清miR-21水平，探討其在預測CKD患者心血管病變發生中的應用價值，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

該研究共納入150例心血管病變患者以及20名健康體檢者，參與者在2014年4月—2015年12月來該院就診或進行例行健康檢查，均簽署了知情同意書，且該研究經鄭州人民醫院倫理委員會批準。CKD患者的平均年齡為（62.1±16.5）歲，其中男性74例（49%，74/150）、女性76例（51%，76/150），對所有患者進行一般臨床資料收集和統計，包括性別、年齡、有無高血壓、空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白a、載脂蛋白b、白蛋白、血肌酐和尿素氮。采用簡化腎臟病飲食改良（MDRD）公式計算患者GFR值：GFR［mL/（min·1.73 m2）］=186×血肌酐-1.154×年齡-0.203×（女性×0.742）×（中國人×1.233）。根據《慢性腎臟病及透析的臨床實踐指南》（簡稱為K/DOQI指南）對慢性腎臟病患者進行分期：1期，GFR≥90 mL/（min·1.73 m2）；2期，GFR 60～89 mL/（min·1.73 m2）；3期，GFR 30～59 mL/（min·1.73 m2）；4期，GFR 15～29 mL/（min·1.73 m2）；5期，GFR＜15［mL/（min·1.73 m2）］或透析。20例健康體檢者作為對照，排除心血管病變及腎臟疾病，平均年齡為（58.6±11.2）歲，其中男女各10名。

1.2血清樣本制備

靜脈采集空腹外周血3～4 mL于真空采血管，常溫下靜置40 min，3500 rpm離心10 min，留取上層血清至1.5 mL離心管中，-70°C保存備用。

1.3實時熒光定量PCR

采用Mini Kit miRNA提取分離試劑盒提取血清miRNA，設計miR-21特異性莖環結構逆轉錄引物以及熒光定量PCR擴增引物，使用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA逆轉錄為cDNA，反應程序如下：42°C，50 min；85°C，5 min。采用miRNA qPCR Detection kit結合特異性擴增引物進行實時熒光定量PCR，檢測血清miR-21表達水平，反應條件如下：預變性95°C，5 min；變性95°C，10 s；退火60°C，45 s；40個循環，循環結束后執行熔解曲線驗證反應產物的特異性，其中以5S rRNA作為內參基因，以2-ΔΔCt方法計算miR-21的相對表達水平：ΔΔCt=腎病（CT-miR-21-CT5s）-健康對照組（CTmiR-21-CT5s）。

1.4肌鈣蛋白I（cTnI）濃度檢測

嚴格按照肌鈣蛋白微粒子化學發光法（貝克曼公司）檢測血清cTnI濃度。

1.5統計方法

使用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行統計分析，卡方檢驗或者One way ANOVA分析不同分期CKD各組之間性別、年齡、血糖、血脂、白蛋白、血肌酐、尿素氮等指標的統計學差異，使用Pearson相關性對血清miR-21水平和cTnI濃度進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般臨床資料

不同分期CKD患者各30例，其中男女比分別為16/14（1期）、18/12（2期）、15/15（3期）、16/14（4期）和14/16（5期），組間差異無統計學意義（P＞0.05）；其中有高血壓的患者例數分別為6（1期）、16（2期）、24（3期）、22（4期）和28（5期），組間差異有統計學意義（P＜0.05）。各組間甘油三酯、總膽固醇、載脂蛋白a和空腹血糖水平均差異無統計學意義（P＞0.05），血肌酐和尿素氮水平隨著病情進展逐漸升高，組間差異具有統計學意義（P＜0.05），而HDL-C、LDL-C和白蛋白水平隨著病情進展逐步降低，組間差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　不同分期慢性腎病患者各項臨床指標［（±s），mL/（min·1.73 m2）］

表1　不同分期慢性腎病患者各項臨床指標［（±s），mL/（min·1.73 m2）］

分期GFR＞9060～9030～6015～30＜15年齡（歲）空腹血糖（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）載脂蛋白a（mmol/L）載脂蛋白b（mmol/L）白蛋白（g/L）血肌酐（umol/L）尿素氮（mmol/L）58.3±15.2 5.10±1.21 1.71±0.82 4.34±1.13 1.45±0.32 3.02±0.68 1.32±0.23 0.92±0.21 42.0±4.58 62±15 4.85±0.83 59.2±12.6 4.82±2.10 1.74±0.91 4.42±1.03 1.34±0.25 2.53±0.41 1.31±0.25 0.84±0.23 37.2±4.62 123±19 6.64±1.26 62.3±13.1 4.92±1.35 1.90±0.82 4.36±0.98 1.20±0.23 2.01±0.78 1.22±0.40 0.91±0.24 33.5±5.12 185±84 14.9±6.68 59.4±14.2 5.42±1.26 2.10±0.81 4.45±0.79 1.17±0.38 2.54±0.53 1.25±0.32 0.90±0.45 32.5±4.52 332±291 18.3±8.52 64.1±12.3 5.41±1.10 1.72±1.10 4.47±0.85 1.04±0.28 2.25±0.58 1.15±0.25 0.74±0.53 35.1±5.51 850±298 23.6±7.21

2.2CKD不同分期血清miR-21的檢出率

20名健康體檢者血清中均檢出miR-21，1期、2期、3期、4期和5期CKD患者血清中miR-21的檢出率分別為53.3%、43.3%、30%、20%和6.66%。隨著GFR值的降低，miR-21的檢出率逐漸降低，終末期腎病患者血清miR-21的檢出率最低，但與其他各期患者相比，miR-21的相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2　健康對照和不同分期慢性腎病患者血清miR-21檢出率比較

2.3CKD患者血清miR-21與cTnI的相關性

研究分析CKD患者血清miR-21與cTnI濃度之間的相關性，結果發現CKD患者血清miR-21表達水平與cTnI濃度呈顯著負相關（r=-0.292，P=0.0009）。

3　討論

近年來，miRNAs已成為研究熱點，它是一類含有18～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，可以通過與其靶基因的3’端非編碼區結合，進行基因表達的調控，從而參與各類疾病和生理過程。此外，研究發現miRNA可從受損細胞中釋放出來進入到外周血中，被稱為循環miRNA，因循環miRNA的檢測具有創傷小、穩定性和特異性高的特點，越來越多的被作為生物學指標用來預測各類疾病。在CKD中，同樣發現大量異常表達的miRNA，Neal等人發現血清miR-16、 miR-21、miR-155和miR-210在CKD中均下調，且與eGFR密切相關［4］。

人類miR-21位于染色體17q23.2，早期研究發現miR-21在多種腫瘤發生發展過程中的細胞增殖、生長、凋亡、侵襲和轉移等發揮重要作用［5］。后來人們逐漸認識到miR-21參與糖尿病腎病的發病機制，且在糖尿病腎病動物模型的腎臟組織中高表達，miR-21可通過調節多條信號通路和關鍵基因參與糖尿病腎病的發生［6］。在IgA腎病患者中，發現miR-21高表達與腎纖維化密切聯系，被認為具有促進腎纖維化的作用［7-8］。近期，左琪等人在CKD患者的尿沉渣中發現miR-21水平較健康組有所升高（19.68±23.85比5.50± 2.99），但差異無統計學意義（P＞0.05），還證實尿沉渣中miR-21水平腎間質纖維化、eGFR存在相關性（r= 0.440，P=0.031；r=-0.811，P＜0.001）［9］。

該研究中，通過檢測不同分期CKD患者血清miR-21水平，發現隨著GFR值的降低，miR-21的檢出率逐漸降低（1期、2期、3期、4期和5期分別為53.3%、43.3%、30%、20%和6.66%），終末期腎病患者血清miR-21的檢出率最低，但與其他各期患者相比，miR-21的相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05），提示血清miR-21可作為預測CKD發展的一個生物學指標。Van Craenenbroeck等人也檢測了CKD患者（n=32）血清中miR-21表達，發現較健康組（n=12）相比略有下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）［10］。由于以上研究并未劃分CKD患者的分期，同時樣本量也較小，可能是造成與該研究結果不一致的可能原因。在另一項研究中，Neal等［4［4］。以上結果與該研究基本一致，但Neal等人的研究并未觀察1期和2期CKD患者血清中miR-21的表達，無法與該研究全部結果進行比較。研究人員近期在魚類模型中發現腎臟miR-21通過促增殖和抗凋亡作用在維持高效的腎小球再生過程中發揮重要功能，具體地來說，當腎損傷時，通過注射anti-miR-21抑制miR-21表達可延緩腎臟再生功能［11］，該結果提示腎臟中miR-21表達對腎損傷后的再生和恢復具有重要意義。

另一方面，該研究還探討了血清miR-21與CKD患者心血管病變之間的關系。cTnI具有高度心肌特異性和靈敏性，在無心肌損傷時，血液cTnI含量非常低，其濃度的升高預示著心肌細胞損傷，因此cTnI被認為是目前心肌損傷最好的確定標志物。該文使用Pearson相關性分析發現血清miR-21水平與cTnI濃度存在負相關。表明miR-21水平與CKD患者心血管病變存在聯系，也提示miR-21可作為CKD患者血管病變的預示指標。而在最新發表的一項研究中，發現血清miR-21在急性心肌梗塞患者中顯著上調，同時與多項心肌損傷標記物如肌酸激酶、肌酸激酶-MB和cTnI存在相關性，并可作為急性心肌梗塞一個潛在的診斷標志物（AUC=0.892，P＜0.05）［12］。以上結果提示miR-21與心肌損傷存在關聯，但其具體作用及其可能機制尚需進一步確認。

綜上，血清miR-21檢測在CKD合并血管病變的發生發展中具有重要指示意義，隨著miR-21在CKD中分子機制的不斷深入研究，不僅可將miR-21作為CKD合并血管病變的診斷指標，同時還可作為治療CKD的靶點，因此具有廣闊的應用前景。

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Significance of Detection of Serum miR-21 in Chronic Kidney Disease Complicated with Cardiovascular Disease

HONG Li-ping1，LIU Bian-ling2，SHEN Bei-li2，XIAO Ai-hua1
1.Department of Internal Medicine，Zhengzhou Yihe Hospital of Henan，Zhengzhou，Henan Proivnce，450000 China；2. Kidney Internal Medicine，Zhengzhou People's Hospital of Henan，Zhengzhou，Henan Province，450000 China

Objective To investigate the significance of serum microRNA-21（miR-21）detection in chronic kidney disease（CKD）complicated with cardiovascular disease.Methods Serum samples from 150 patients in our hospital for routine health examination with CKD were collected from December 2014 to April 2015，and 20 healthy subjects were used as control.The expression level of miR-21 in serum was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results 20 cases of miR-21 were detected in sera of healthy persons and CKD patients with different stage（1，2，3，4，5）of serum miR-21 detection rate was 53.3%（16/30），43.3%（13/30）and 30%（9/30），20%（6/30）and 6.66%（2/ 30）respectively.CKD patients with glomerular filtration rate（GFR）value decreased，the detection rate of miR-21 decreased gradually and CKD stage of miR-21 expression level difference was not statistically significant expression of miR-21 in volume and cardiac troponin I（cTnI correlation was statistically significant（r=0.292，P=0.0009）.Conclusion CKD patients often accompanied with different degrees of cardiovascular disease，miR-21 can be used as the early warning signs of cardiovascular disease in patients with CKD.

Chronic kidney disease；Cardiovascular disease；miR-21

R446.11

A

2096-1782（2016）09－0062-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.09.062

2016-06-15）

洪麗萍（1981.12-），女，河南信陽人，碩士，主治醫師，研究方向：慢性腎炎。

肖愛華（1964.1-），女，河南遂平人，本科，主任醫師，研究方向：糖尿病腎病，慢性腎臟病一體化治療，E-mail：xah6569@sina.com。