XAV939對卵巢癌細胞侵襲遷移的影響及Wnt/β-catenin信號的抑制作用

汪彩霞,陳　說,趙　楊

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XAV939對卵巢癌細胞侵襲遷移的影響及Wnt/β-catenin信號的抑制作用

汪彩霞1,陳說2,趙楊2

目的探討XAV939對卵巢癌細胞侵襲轉移方面的影響及其對Wnt/β-catenin信號轉導途徑的抑制作用。方法采用MTT法檢測XAV939對卵巢癌細胞活力的抑制作用，劃痕實驗觀察XAV939對細胞遷移能力的影響，Transwell細胞遷移實驗檢測XAV939對卵巢癌細胞侵襲轉移的影響，Westernblot方法檢測wnt1、β-catenin、TCF4蛋白以及基質金屬硫蛋白9(Metallothioneinmatrixprotein，MMP9)的表達水平。結果XAV939作用48h后，抑制率明顯上升,尤其濃度達到8μmol/L(31%±1%,P=0.034)、16μmol/L(51%±4%,P=0.028)，且劃痕和Transwell實驗結果顯示XAV939能抑制卵巢癌的侵襲和轉移。此外，westernblot結果顯示，wnt1、β-catenin、TCF4、MMP9的表達水平均有所降低。結論XAV939通過Wnt/β-catenin信號通路來抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移。

卵巢癌;XAV939;Wnt/β-catenin信號轉導通路; 侵襲遷移

近年來，卵巢癌是危及女性健康的惡性腫瘤，居女性生殖系統惡性腫瘤的第2位[1]。盡管手術切除和化學療法取得了一定的療效，但是卵巢癌的侵襲轉移成為患者高病死率居高不下的根源。卵巢癌的侵襲和轉移是多基因多因素作用的過程。臨床試驗表明，卵巢癌的發生與基因突變和信號轉導通路的失調有著密切的關系。越來越多的證據顯示，wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發生發展聯系緊密。因此，針對β-catenin基因的靶向治療已經成為這一領域的研究熱點。XAV939是Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制藥[2]，在肝癌[3]、神經母細胞瘤[4]等癌癥中研究甚多。在胃癌研究[5]中認為，它可以抑制腫瘤的發生發展，但是在卵巢癌的研究中比較少見。本實驗采用XAV939作用于卵巢癌細胞，探究其對卵巢癌侵襲遷移的影響，從而為臨床卵巢癌的治療提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料卵巢癌細胞系OVCAR3購自ATCC細胞庫(美國)。XAV939購自上海惠誠生物科技有限公司，MTT購自Amresco，Transwell培養板購自BD公司(美國)，RPMI1640購自Hyclone公司。β-catenin和Wnt1購自Santacruzbiotechnology，MMP9和TCF4購自Proteintech。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養OVCAR3細胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640培養液置37 ℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的條件下培養。1～2d換液傳代1次，當細胞處于對數生長期進行實驗。

1.2.2MTT法測定IC50收集對數期細胞，以3×103個/孔接種于96孔板，置于5%CO2,37 ℃孵箱中孵育過夜，加入不同濃度(0、0.125、0、25、0.5、1、2、4、8、16、32μmol/L)XAV939，同時設1個對照組(DMSO)和1個空白組，每組設3個復孔，培養48h。然后，每孔加入20μl0.5%MTT溶液，繼續培養4h。棄去培養液，每孔加入150μlDMSO，于490nm波長處測定吸光度值。

1.2.3劃痕試驗取對數生長期的細胞接種于6孔板中，大約5×105/(ml·孔)。待細胞單層鋪滿培養基時，用200μl的Tip頭進行劃痕。用PBS清洗細胞2～3次，去除細胞碎片。并在實驗組加入不同濃度的XAV939。置于37 ℃，5%CO2的條件下進行培養，分別在0、48h取樣拍照。

1.2.4Transwell試驗在已鋪好膠Transwll的下室加入500μl含10%的胎牛血清RPMI1640培養液，上室加入200μL無血清的細胞懸浮液(2.5×105個/ml)及不同濃度梯度的XAV939，并放置在37 ℃，5%CO2進行孵育24h。然后，用4%多聚甲醛溶液固定20min，PBS清洗后用0.1%結晶紫染色，于Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察計算穿過Matrigel聚合膠及小室微孔膜的細胞數。

1.2.5Westernblot檢測蛋白表達水平于處理后的細胞加入裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA法進行定量分析。配膠、上樣(樣品加入2×SDS加樣緩沖液)并進行SDS—PAGE凝膠電泳分離蛋白。轉移至PVDF膜，4 ℃封閉過夜。一抗室溫孵育2h，棄掉一抗，加入二抗，于室溫平緩搖動2h。每次孵育后均用TBST洗薄膜3次。采用ECL化學發光法檢測相關蛋白。等比例混合發光劑和增強劑，反應 5min。放入暗盒進行X線顯影，觀察結果。

1.2.6統計學處理采用SPSS10.0統計軟件進行結果分析，兩樣本之間進行獨立樣本t檢驗，多樣本之間進行方差分析，P<0.05具有統計學意義。

2　結　　果

2.1MTT實驗MTT結果顯示，以DMSO組為對

照，XAV939作用48h后對卵巢癌細胞的抑制率呈濃度依賴性，其抑制率分別為2μmol/L(17%±0.4%)、4μmol/L(19%±1%)、8μmol/L(31%±1%)、16μmol/L(51%±4%)、32μmol/L(55%±2%)，P<0.05差異具有統計學意義。因此，確定后續實驗XAV939的干預濃度為2、4、8和16μmol/L。見圖1。

圖1　不同濃度的XAV939作用48 h后對OVCAR3細胞活力的影響①P<0.05

2.2劃痕試驗和Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力劃痕試驗結果顯示(圖2)，卵巢癌細胞OVCAR3經過4、8、16μMXAV939處理48h后細胞遷移能力顯著降低，呈現劑量依賴性。遷移率由DMSO組(0.31±0.02)降低至4μM(0.2±0.04)、8μM(0.16±0.02)、16μM(0.09±0.04)，均P<0.05,差異具有統計學意義。

Transwell試驗結果顯示(圖3)，穿過小室的癌細胞數目DMSO組(773±35)明顯高于4μmol/L(620±49)、8μmol/L(436±17)、16μmol/L(322±13)，均P<0.05，差異具有統計學意義。并且隨著濃度的增加，穿過小室的細胞更少。

2.3Westernblot檢測β-catenin、wnt1、TCF4、MMP9表達水平的變化Westernblot實驗(圖4)表明，wnt信號通路的蛋白wnt1、β-catenin、TCF4、MMP9的表達水平均有所降低，且這些變化都呈濃度依賴性。

圖2　XAV939對OVCAR3細胞的影響

圖3　XAV939對OVCAR3細胞侵襲能力的影響細胞侵襲(放大倍數×20)能力明顯下降。①P<0.05。所有試驗均重復3次

圖4　XAV939對TCF4、β-catenin、wnt-1

3　討　　論

腫瘤侵襲和轉移能力是腫瘤惡變的標志。分子生物學研究發現，惡性腫瘤的侵襲轉移與wnt/β-catenin信號轉導通路密切相關。Jang等[6]通過靶向敲除wnt1，發現乳腺癌的侵襲和轉移能力明顯受到抑制。同樣在卵巢癌上皮細胞癌的研究中，實驗數據顯示β-catenin在卵巢癌組織的的表達大于正常組織，這些結果提示wnt/β-catenin在卵巢癌的侵襲和轉移起著重要的作用[7]。筆者采用wnt/β-catenin信號通路的特異性抑制劑XAV939來處理卵巢癌細胞，發現XAV939能夠抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力，并且呈劑量依賴性。筆者發現，應用XAV939處理卵巢癌細胞后，wnt1，β-catenin表達下降，TCF4與MMP9的表達也下降。

β-catenin以結合型和游離型存在于細胞中，前者通過與上皮鈣黏蛋白E-cadherin結合來調節細胞間的黏附；后者通過wnt信號通路，作用于細胞核內的轉錄因子LEF/TCF，來參與腫瘤發生發展的過程[7]。wnt/β-catenin信號轉導途徑的激活機制是一個錯綜復雜的過程。大量的實驗研究得出，在wnt蛋白缺失的情況下，胞內的β-catenin被磷酸化進而由蛋白酶降解，因此在胞內保持著較低水平。當wnt蛋白存在的情況下，β-catenin低磷酸化水平導致胞內的β-catenin的累積，隨之進入細胞核內，通過與LEF/TCF形成轉錄起始復合物來調控相關基因的表達[8，9]。作為wnt信號通路的分子開關，TCF家族對腫瘤的侵襲和轉移抑制起著重要作用，尤其是TCF4與腫瘤的發生發展密切相關[10]。

Sanchez-TilloE[11]等發現，β-catenin/TCF4通過上皮間充質轉化途徑來介導腫瘤的侵襲和轉移。

此外，細胞外基質ECM降解在腫瘤的侵襲和轉移也起著重要作用。越來越多的實驗證明，基質金屬硫蛋白MMPs的異常與腫瘤的轉移密不可分，如胃癌[12]、肝細胞癌[13]。王紅民等[14]通過對肺癌的研究發現，MMP9在低分化的肺癌中高水平表達。體外侵襲實驗表明，低水平的MMP9能增強細胞間的附著能力，從而抑制了腫瘤的轉移，這可能與MMP能降解ECM的作用有關[15，16]。多項研究顯示，wnt信號通路通過核內β-catenin來激活MMPs，進而介導癌細胞的侵襲和遷移能力[17，18]。

綜上所述，本研究發現，XAV939不僅抑制wnt/β-catenin信號通路，并且還可以通過抑制其下游的基因TCF4及MMP9來抑制卵巢癌的侵襲和轉移。通過本研究，筆者首次提出XAV939通過wnt/β-catenin信號通路來抑制卵巢癌的侵襲和轉移，并為卵巢癌的治療策略開拓了新思路。

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(2015-10-14收稿2015-12-20修回)

(責任編輯梁秋野)

AStudyonXAV939’sfunctionininhibitingovariancancercellsmigrationandinvasion

WANGCaixia1,CHENShuo2,andZHAOYang2.

1.ChinaMedicalUniversity，Shenyang110013,China; 2.GynecologyDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

ObjectiveToinvestigatetheeffectsofXAV939oninvasionandmetastasisofovariancancercellsaswellastheinhibitionoftheWnt/β-cateninsignalingpathway.MethodsTheMTTassaywasusedtodetecttheinhibitioneffectofXAV939ontheviabilityofovariancancer,theinhibitionofcellmetastasiswasdetectedbyscratchtestandtranswellcellmigrationassay,theexpressionlevelofβ-catenin,wnt1,TCF4andMMP9proteinbyWesternblotting.ResultsTheMTTassayshowedthattheinhibitionrateofovariancancerincreasedsignificantlybyXAV939for48h,especiallytheconcentrationof8μmol/L(31%±1%,P=0.034),16μmol/L(51%±4%,P=0.028).ScratchtestandtranswellcellmigrationassayshowedtheinhibitionofinvasionandmetastasisafterXAV939treatment.Inaddition,theresultsofWesternblottingshowedthatXAV939reducedtheexpressionofwnt1,β-catenin,TCF4,andMMP9protein.ConclusionXAV939caninhibittheinvasionandmigrationofovariancancercellsthroughWnt/β-cateninpathway.

ovariancancer;XAV939;wnt/β-cateninsignalingpathway;invasionandmetastasis

國家自然基金項目(81202049, 81472440)

汪彩霞，碩士。

1.110013沈陽，中國醫科大學臨床醫學七年制(實驗班)；2.110001沈陽，中國醫科大學附屬第一醫院婦科

趙楊，E-mail:yida.zhaoyang@163.com

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