19份苜蓿種質遺傳多樣性的ISSR分析

王健勝，侯桂玲，程立平，謝永鳳

(1. 平頂山學院，河南　平頂山　467000；2. 中國農業科學院草原研究所，內蒙古　呼和浩特　010010)

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19份苜蓿種質遺傳多樣性的ISSR分析

王健勝1，侯桂玲1，程立平1，謝永鳳2

(1. 平頂山學院，河南平頂山467000；2. 中國農業科學院草原研究所，內蒙古呼和浩特010010)

采用ISSR分子標記技術對19份國內外苜蓿種質的遺傳多樣性進行檢測分析。12對ISSR引物在供試苜蓿材料中共獲得有效擴增位點71個，其中多態性位點69個，多態性位點百分率為96.25%。引物的有效等位基因數、Nei′s基因多樣性指數、Shannon′s信息指數和多態性信息含量平均分別為1.50、0.30、0.46和0.33。供試苜蓿材料的遺傳相似系數介于0.296～0.887，平均為0.617，表明被研究苜蓿材料遺傳異質性較好。聚類分析結果顯示，供試材料在遺傳相似系數0.522處可被劃分為兩大類，第1類群包括的苜蓿種質數達到17個，占到所有供試苜蓿種質總數的89.47%，第2類群包含的苜蓿種質數只有2個。主成分分析獲得了與聚類分析基本一致的結論。

苜蓿；遺傳多樣性，ISSR分析

苜蓿MedicagoL.是世界上最重要的豆科牧草，俗稱“牧草之王”[1]，具有適應性廣、產量高、營養豐富、土壤固氮、改善生態環境等優點，已成為世界上種植面積最廣的牧草之一。我國是世界上苜蓿主要種植國家之一。多樣的氣候特點使我國也成為世界上苜蓿種質資源較豐富的國家之一，而我國開展苜蓿種質創新利用的相關基礎研究較少，這在很大程度上已限制了我國苜蓿優良品種的培育效率。目前，我國苜蓿品種無論在數量上還是品質上均無法滿足生產的需求。因此，開展苜蓿種質資源研究已顯得尤為重要。

苜蓿種質遺傳多樣性研究是苜蓿育種和遺傳改良的基礎。分子標記是以DNA多態性為基礎的遺傳標記，已經成為苜蓿種質資源評價和利用的有力工具。目前，包括AFLP[2]、RFLP[3]、RAPD[4-6]、SSR[7-8]等多種分子標記均被應用于苜蓿種質資源研究中。ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)標記，即簡單重復序列區間DNA標記，具有穩定性好，多態性高，試驗操作簡單、快速、DNA用量少等優點，因此該技術已成為研究苜蓿種質資源及遺傳多樣性的有效手段。張穎娟等[9]采用ISSR標記對12份苜蓿材料的遺傳多樣性進行了研究，結果表明，苜蓿的遺傳分化主要發生在種群內，聚類分析結果認為，紫花苜蓿與雜花苜蓿的親緣關系較近，而與黃花苜蓿的親緣關系較遠。劉磊等[10]利用ISSR分析了紫花苜蓿、黃花苜蓿和胡盧巴屬植物的親緣關系，結果發現，紫花苜蓿、扁蓿豆和黃花苜蓿有較廣遺傳基礎，胡盧巴種質材料相對于紫花苜蓿種質材料與黃花苜蓿的親緣關系更近。李紅等[11]利用10個ISSR引物對30份苜蓿材料的遺傳多樣性進行了分析，發現該群體的遺傳多樣性水平較高，聚類分析結果將30份苜蓿材料劃分為3個類群，第1類包括準格爾、敖漢、肇東等19份種質材料，金達苜蓿單獨劃分為1類，第3類包括和平、德寶等10份種質材料。ISSR也被用于苜蓿抗病材料的研究中，孟芳等[12]運用ISSR標記對苜蓿F1代抗褐斑病基因進行了研究，結果篩選到與苜蓿褐斑病緊密連鎖的5個ISSR標記。

本研究采用ISSR分子標記技術對國內外19份苜蓿種質進行分子鑒定和比較分析，初步闡明供試種質的遺傳多樣性，以期為苜蓿種質資源的有效利用和優良苜蓿新品種培育提供一定理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

本試驗利用的苜蓿材料共有19份，具體信息詳見表1。

1.2 DNA提取

每份材料隨機選取10～15個單株幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法[13]混合提取基因組總DNA，經紫外分光光度計測定濃度后，稀釋至適合濃度用于苜蓿基因組PCR擴增檢測。

1.3ISSR標記檢測

PCR擴增反應在Eppendorf PCR擴增儀上完成。PCR反應總體積為20 μL，包括1.5 μL基因組DNA 40 ng，2.0 μL引物(20 mmol·L-1)，2.0 mL 10×PCR緩沖液(含Mg2+)，2.0 μL底物dNTPs(2.5 mmol·L-1)，1.0 μLTaq酶(2 U·μL-1)和11.5 μL ddH2O。

ISSR-PCR 擴增程序為：94℃ 5 min，47個循環(94℃ 30 s，51℃ 45 s，72℃ 1.5 min)，最后72℃ 5 min。擴增產物用1.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并在紫外凝膠成像系統上保存分析，同時為了保證試驗的準確性，每個ISSR反應重復2次以上(表2)。

表1　供試材料基本信息

表2研究所用ISSR引物序列及退火溫度

Table 2Sequence and annealing temperature for ISSR primers used on alfalfa

1.4數據統計及分析

以0、1、9統計ISSR擴增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立分子數據矩陣。利用NTSYS-pc2.10軟件通過非加權平均法(UPMGA)計算苜蓿種質間的遺傳相似系數，并在此基礎上作聚類分析及主成分分析。采用POPGEN32軟件估算ISSR標記的主要遺傳多樣性參數，包括引物擴增總條帶數(TNB)、多態性條帶數(NPB)、多態性條帶百分比(PPB)、有效等位基因數(Ne)、Nei′s基因多樣性指數(H)、Shannon′s信息指數(I)和多態性信息含量(PIC)。

2　結果與分析

2.1苜蓿種質ISSR多態性分析

從33個ISSR引物中篩選出多態性豐富、穩定性好的引物共12個，引物篩選率為36.36%。利用篩選出的12個ISSR引物對供試苜蓿種質進行了檢測分析，不同引物的表現情況詳見表3。從表上可以看出，不同ISSR引物對苜蓿基因組的擴增存在較大差異。在擴增條帶衡量指標方面，單個ISSR引物擴增條帶數分布在3～9個，平均為5.92個；多態性條帶數也分布在3～9個，平均為5.75個；引物多態性條帶百分率表現良好，其分布范圍為75%～100%，除ISSR14和ISSR31外，其余ISSR引物的多態性條帶百分率均為100%，多態性條帶百分率平均達到了96.25%。不同ISSR標記間的遺傳參數表現差異也較大。有效等位基因數分布在1.31～1.74，平均為1.50；Nei′s基因多樣性指數的分布范圍是0.21～0.42，平均為0.30；所有引物的Shannon′s信息指數都較高，其分布范圍在0.34～0.55，平均為0.46。多態性信息含量是衡量分子標記有效性的重要指標之一，從表上不難看出，不同ISSR標記的多態性信息含量差異較大，其分布范圍介于0.19～0.41，平均為0.33。

表3　苜蓿ISSR標記遺傳多樣性參數

2.2不同苜蓿種質親緣關系分析

基于ISSR檢測數據獲得了苜蓿種質間的遺傳相似系數，具體詳見表4。從表上可以看出，不同苜蓿種質間遺傳相似系數差異較大，遺傳相似系數分布在0.296～0.887，其中苜蓿種質08432與種質08440間的遺傳相似系數最小，而種質00399與種質00038間的遺傳相似系數最大，這表明，與其他苜蓿種質相比，種質08432與種質08440間的親緣關系最遠，而種質00399與種質00038間親緣關系最近。同時可以看出，所有苜蓿種質平均遺傳相似系數為0.617，表明供試苜蓿種質整體遺傳差異水平較高，其在未來苜蓿遺傳育種相關研究中具有較好的利用效果。

表4　不同苜蓿種質間的遺傳相似系數

2.3不同苜蓿種質聚類分析

以ISSR標記檢測為基礎對19份苜蓿種質進行了聚類分析，具體結果詳見圖1。從圖上可知，19份苜蓿種質在遺傳系數0.526處可被劃分為兩大類，第1類群包括的苜蓿種質數最多，達到了17個，占到所有供試苜蓿種質總數的89.47%，其中國內苜蓿種質12個，國外苜蓿種質5個；第2類群包含的苜蓿種質數只有2個，均來自國內，分別是0844 0和0844 6。根據第1類群中苜蓿種質的親緣關系的遠近，該類群在遺傳相似系數0.636處又可劃分為兩個亞群，第1亞群共包括6個苜蓿種質，其中3個國外種質，3個國內種質，第2亞群也由11個苜蓿種質構成，除5S43和三得利外，其余均為國內苜蓿種質。

2.4苜蓿種質主成分分析

以ISSR標記檢測數據為基礎，對19份苜蓿種質進行了主成分分析，具體分析結果見圖2。在主成分分析中，前3個主成分能解釋的總遺傳變異較高，達到了45.50%。從圖上可以看出，主成分分析獲得了與聚類分析完全一致的結果，聚類分析中被聚為同一類群的苜蓿種質在主成分分析中也被劃分為一類，由此可見，主成分分析結果也在一定程度上能夠準確反映出不同苜蓿種質間親緣關系的遠近。

3　討論與結論

3.1苜蓿種質ISSR多樣性分析

苜蓿遺傳多樣性研究是苜蓿種質創新利用和遺傳改良的重要基礎。本研究利用12個多態性豐富的ISSR引物對19份國內外苜蓿種質進行了研究，共擴增出有效基因位點71個，其中多態性位點69個，多態性百分率為96.25%，該結果與張穎娟等[9]研究存在一定的差異，雖然本研究獲得的平均基因位點數較少，但多態性條帶百分率要高于后者，這可能與不同研究材料有關。分子標記對苜蓿基因組的擴增效果是開展苜蓿種質遺傳多樣性分析的重要基礎，而分子標記多樣性參數是衡量該標記擴增效果的重要指標，雖然前人利用ISSR標記對苜蓿種質已做了部分研究，但對ISSR標記擴增效果的分析主要集中于擴增條帶數、多態性條帶數和多態性位點百分比[14-15]方面，分析指標較為單一。本研究對利用的12個ISSR標記的7個重要多樣性參數進行了較為系統的分析，結果表明，不同ISSR標記的多樣性參數表現存在較大差異，所有ISSR標記的有效等位基因數、Nei′s基因多樣性指數、Shannon′s信息指數和多態性信息含量平均分別為1.50、0.30、 0.46和0.33，這表明ISSR標記在檢測苜蓿遺傳多樣性方面效果較好，綜合比較認為，ISSR1、ISSR9、ISSR15、ISSR32、ISSR33的檢測效果相對最好。

3.2苜蓿材料間的親緣關系分析

苜蓿種質親緣關系分析是開展苜蓿種質有效利用的重要基礎。只有掌握了苜蓿種質間的親緣關系，我們才能根據不同苜蓿農藝性狀的特點進行有效的親本選配，最終通過對優異雜交后代的選擇，培育出適合生產需求的優良苜蓿新品種。本研究通過對19份國內外苜蓿種質遺傳多樣性的分析，結果發現，供試苜蓿種質平均遺傳相似系數為0.617，陳立強等利用SSR標記對41份苜蓿種質遺傳多樣性作了分析，獲得苜蓿種質平均遺傳相似系數為0.791，通過比較不難發現，本研究供試苜蓿種質遺傳差異性水平較高，其親緣關系較遠。同時，研究發現，苜蓿種質的親緣關系遠近與其所處地理位置相關性不大，來源于地理位置很近的苜蓿種質不一定具有很近的親緣關系。本研究中親緣關系最遠的2個苜蓿種質均來自國內，即苜蓿種質08432與種質08440，同樣的現象也在苜蓿種質聚類分析及主成分分析中也得到了一定的體現，從圖1和圖2上可以看出，來自國外的苜蓿種質與國內苜蓿種質經常被聚為一類。根據親緣關系的遠近，本研究最終將19份苜蓿種質聚為兩大類。苜蓿種質親緣關系的解析將為苜蓿種質在未來苜蓿育種中的有效利用提供可靠依據，特別是對那些農藝性狀優良、親緣關系較遠的苜蓿種質而言，其未來在苜蓿育種中的利用前景尤為廣闊。

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(責任編輯：柯文輝)

Genetic Diversity of Nineteen Alfalfa (MedicagoL.)Germplasms Analyzed Using ISSR Markers

WANG Jian-sheng1, HOU Gui-ling1,CHENG Li-ping1，XIE Yong-feng2

(1.PingdingshanUniversity,Pingdingshan，Pingdingshan，He′nan467000,China;2.GrasslandInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Hohehaote，Neimenggu010010,China)

Genetic diversities of 19 domestic and foreign alfalfa germplasms were analyzed using ISSR markers. A total of 71 effective loci were obtained for the germplasms using 12 ISSR primers, of which 69 loci were polymorphic, i.e., 96.25% of the total. The mean effective number of alleles(Ne), Nei's gene diversity(H), Shannon's information index(I), and polymorphism information content(PIC) were 1.50, 0.30, 0.46, and 0.33, respectively. The genetic similarity coefficients of the alfalfa germplasms ranged from 0.296 to 0.887, averaging 0.617, suggesting ahigh genetic heterogeneityamong the germplasms. According to a cluster analysis, all of the alfalfa germplasms could be divided into 2 groups at the genetic similarity coefficient of 0.522.One group consisted of 17 germplasms, accounting for 89.47% of the total. Another group had 2 alfalfa germplasms only. A same result was obtained by the principal component analysis. The information could be used for identification and effective utilization of the alfalfa germplasms.

alfalfa; genetic diversity; ISSR analysis

2016-01-27初稿；2016-04-06修改稿

王健勝(1978-)，男，講師，博士，主要從事作物遺傳育種研究(E-mail：wjsheng1998@163.com)

河南科技廳科技攻關項目(KJT142102110171)；平頂山市科技計劃項目(2014086)

S 541+,102

A

1008-0384(2016)07-708-06

王健勝，侯桂玲，程立平，等.19份苜蓿種質遺傳多樣性的ISSR分析[J].福建農業學報，2016，31(7)：708-713.

WANG J-S，HOU G-L，XIE Y-F，et al.Genetic Diversity of Nineteen Alfalfa (MedicagoL.)Germplasms Analyzed Using ISSR Markers[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：708-713.