不同方法提取黃野螟性信息素粗提物組分GC-MS分析

張勝男，沈婧，牟靜，秦文權(quán)，羅晶，張錦坤，溫秀軍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，廣東廣州　510642）

不同方法提取黃野螟性信息素粗提物組分GC-MS分析

張勝男，沈婧，牟靜，秦文權(quán)，羅晶，張錦坤，溫秀軍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，廣東廣州510642）

黃野螟（Heortia vitessoides Moore）是一種嚴(yán)重危害珍貴樹(shù)種土沉香（Aquilaria sinensis）的食葉害蟲(chóng)。該研究采用吸附法、溶劑提取法、腺體直接進(jìn)樣法等3種方法獲得性信息素的粗提物，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：吸附法的粗提物有87個(gè)物質(zhì)峰，性信息素疑似物2種，分別為Z8-12:OH和E8，E10-12:OH；溶劑提取法的粗提物有163個(gè)物質(zhì)峰，性信息素疑似物2種，分別為Z8-12:OH和Z7-12:Ac；腺體直接進(jìn)樣法沒(méi)有從其樣本分析出黃野螟性信息素的疑似成分。試驗(yàn)比較了不同方法之間的差異，研究結(jié)果可為黃野螟性信息素組分提取分析提供參考。

黃野螟；性信息素；提取方法

黃野螟（Heortia vitessoides Moore）屬鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是我國(guó)土沉香（Aquilaria sinensis）種植區(qū)發(fā)生的重要食葉害蟲(chóng)[1]。國(guó)內(nèi)主要分布于廣東、云南、福建、廣西、海南、臺(tái)灣、香港等地；國(guó)外廣泛分布在印度、尼泊爾、斯里蘭卡、斐濟(jì)等國(guó)家[2]。它以幼蟲(chóng)咬食土沉香葉片危害，由于蟲(chóng)口密度大，生長(zhǎng)速度快，大發(fā)生時(shí)常把葉片吃光，造成土沉香光禿無(wú)葉，嚴(yán)重影響植株的健康生長(zhǎng)[3]。近年來(lái)，隨著土沉香的大面積推廣種植，黃野螟的危害日益嚴(yán)重。

傳統(tǒng)的化學(xué)防治易導(dǎo)致黃野螟產(chǎn)生抗藥性，應(yīng)用昆蟲(chóng)性信息素監(jiān)測(cè)害蟲(chóng)發(fā)生和防治，具有用量少、靈敏度高、專(zhuān)一性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，已得到世界各地普遍認(rèn)可[4]。目前，對(duì)于黃野螟的研究多側(cè)重于生物學(xué)特性及發(fā)生規(guī)律[1]、雌雄蛹鑒定[5]、幼蟲(chóng)頭部感器掃描觀察[6]、植物源揮發(fā)物對(duì)黃野螟驅(qū)避引誘作用[7]和化學(xué)藥劑防治黃野螟等[8-9]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃野螟性信息素粗提物提取方法進(jìn)行分析比較，找出最適宜的提取方法。為測(cè)定黃野螟性信息素奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試蟲(chóng)源

試驗(yàn)所需黃野螟成蟲(chóng)采自于廣州市白云區(qū)太和鎮(zhèn)繆屋土沉香樹(shù)上黃野螟幼蟲(chóng)，于2015年9～10月在實(shí)驗(yàn)室（25依1）益、D：L=8頤16、濕度75%依5%的人工智能氣候條件下飼養(yǎng)，以寄主植物土沉香葉片飼喂，化蛹羽化后所得。

1.2主要儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（agilent，7890A）。

1.3黃野螟性信息素粗提物的采集方法

1.3.1吸附法

取吸附片（MonoTrap，日本GL Sciences，直徑1cm，厚0.3mm）置于有機(jī)玻璃制成的容器內(nèi)（17cm伊18cm伊40cm），容器內(nèi)放50頭處女雌蛾，12h后取出第1批，放入同樣數(shù)量相同齡期的第2批處女雌蛾，在（25依1）益條件下共吸附24h，將吸附片置于含有400滋L重蒸二氯甲烷的解析瓶?jī)?nèi)，超聲波解析5min后，馬上進(jìn)行性信息素成分測(cè)定或置于-20益的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2溶劑提取法

將黃野螟剛羽化的雌蟲(chóng)放入人工氣候箱內(nèi)［溫度（25依1）益、濕度75%依5%、暗期09：00-17：00）］飼養(yǎng)，待其2日齡并進(jìn)入暗期2～4h時(shí)取出，為方便操作，在-20益冰箱內(nèi)冷凍5min后，用拇指與食指輕壓蟲(chóng)體腹部，擠出腹部腺體，用眼科手術(shù)剪剪取腺體，按每腺體10滋L重蒸正己烷浸泡。浸泡液在25益條件下，置于人工搖床上，搖晃50min后，用醫(yī)用一次性注射器吸取浸泡液，過(guò)濾后，移置色譜瓶?jī)?nèi)，氮?dú)猓魉贋?00mL/min）濃縮10倍后，馬上進(jìn)行性信息素成分測(cè)定或置于-20益的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3腺體直接進(jìn)樣法

將2日齡暗化3h的黃野螟處女雌蛾，在-20益冷凍5min后，食指與拇指輕壓蟲(chóng)體腹部，迫使其伸出腺體，用眼科手術(shù)剪刀剪取腺體，將腺體置于一特殊玻璃小管內(nèi)，每小管放3個(gè)腺體。然后放置于GC-MS一特制的熱分離進(jìn)樣桿內(nèi)，腺體直接氣化進(jìn)入GC-MS進(jìn)行性信息素成分分析。

1.4黃野螟雌蟲(chóng)性信息素成分的分析

對(duì)經(jīng)觸角定位儀測(cè)定確認(rèn)含有性信息素成分的粗提物或處于釋放性信息素的腺體進(jìn)行GC-MS分析，并參考已知鱗翅目昆蟲(chóng)性信息素成分，初步確認(rèn)黃野螟雌蟲(chóng)性信息素的活性成分。

GC-MS設(shè)置。分析條件：柱子型號(hào)：DB-5毛細(xì)柱（非極性柱，30m伊250滋m伊0.25滋m）。升溫程序：40益保持3min，然后每分鐘上升6益到270益，保持3min，進(jìn)樣口溫度260益。載氣為氦氣。溶劑延遲5min。采集模式：全掃描，火焰離子化檢測(cè)器（FID）檢測(cè)。無(wú)分流進(jìn)樣，界面溫度250益，離子源溫度230益。MS四極桿150益，增益系數(shù)1.00，載氣為He，流量為1mL/min。EI電子轟擊，檢測(cè)器電壓350V，發(fā)射電流150滋A。采集速度0.6s/次，原子質(zhì)量單位采集質(zhì)量范圍40～330amu，開(kāi)始采集時(shí)間3min。采用Windows NT/Xcalibur軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析。

（1）反復(fù)潤(rùn)洗進(jìn)樣針數(shù)次后，吸取1滋L重蒸正己烷進(jìn)樣。

（2）結(jié)果顯示雜質(zhì)峰較少時(shí)，吸取1滋L樣品進(jìn)樣分析；化合物通過(guò)NIST和Willey質(zhì)譜庫(kù)鑒定。

2　結(jié)果分析

2.1吸附法

對(duì)吸附法提取的性信息素粗提物進(jìn)行GC-MS分析，得到總離子流圖（圖1）。用GC-MS分析軟件在總離子流圖上自動(dòng)積分，得到87個(gè)可識(shí)別的物質(zhì)峰。昆蟲(chóng)性信息素在結(jié)構(gòu)上有較大的相似性，多數(shù)為長(zhǎng)鏈不飽和醇、醋酸脂、醛或酮類(lèi)，鏈長(zhǎng)一般為10～18碳，碳鏈長(zhǎng)度為C12、C14、C16的約占目前已知昆蟲(chóng)性信息素總數(shù)的90%，這些化合物的分子量范圍分布在158～308之間[10]。在質(zhì)譜庫(kù)中對(duì)每個(gè)物質(zhì)峰進(jìn)行檢索，參照已知鱗翅目昆蟲(chóng)性信息素成分，得到2種黃野螟性信息素疑似組分[11]，見(jiàn)表1。將GC-MS分析給出的表1中的2種化合物質(zhì)譜圖與譜庫(kù)中的標(biāo)樣質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比（圖2、圖3）進(jìn)一步確定這2種物質(zhì)名稱(chēng)。

圖1　吸附法的黃野螟性信息素粗提物成分的總離子流

表1　吸附法的性信息素粗提物可能含有的性信息素組分

圖2　Z8-12:OH質(zhì)譜圖與質(zhì)譜庫(kù)標(biāo)樣質(zhì)譜圖對(duì)比

圖3　E8，E10-12:OH質(zhì)譜圖與質(zhì)譜庫(kù)標(biāo)樣質(zhì)譜圖對(duì)比

2.2溶劑提取法

用重蒸正己烷提取的黃野螟性信息素粗提物進(jìn)行GC-MS分析得到總離子流圖，如圖4所示。通過(guò)用GC-MS分析軟件在總離子流圖上自動(dòng)積分后，得到可識(shí)別物質(zhì)峰163個(gè)，在質(zhì)譜庫(kù)中對(duì)每個(gè)物質(zhì)峰進(jìn)行檢索，參照已知鱗翅目昆蟲(chóng)性信息素成分，得到2種可能是黃野螟性信息素組分，見(jiàn)表2。將GC-MS分析給出的這2種質(zhì)譜圖與譜庫(kù)中的標(biāo)樣質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比（圖5、圖6）進(jìn)一步確定這2種物質(zhì)名稱(chēng)。該方法提取是浸泡大量處女雌蛾腺體，所以其粗提物中性信息素物質(zhì)含量較大，這在總離子流圖上相應(yīng)顯示了峰較大面積。

圖4　溶劑提取法的黃野螟性信息素粗提物成分的總離子流

表2　溶劑提取法的粗提物可能含有的黃野螟性信息素組分

圖5　Z8-12:OH質(zhì)譜圖與質(zhì)譜庫(kù)標(biāo)樣質(zhì)譜圖對(duì)比

圖6　Z7-12:Ac質(zhì)譜圖與質(zhì)譜庫(kù)標(biāo)樣質(zhì)譜圖對(duì)比

2.3腺體直接進(jìn)樣法將3個(gè)正處于釋放性信息素的黃野螟處女雌蛾腺體直接放入GC-MS分析得到總離子流圖（圖7），通過(guò)用GC-MS分析軟件在總離子流圖上自動(dòng)積分后，得到可識(shí)別物質(zhì)峰151個(gè)，對(duì)比質(zhì)譜庫(kù)檢索，并結(jié)合對(duì)比質(zhì)譜圖，未發(fā)現(xiàn)不飽和醇、醋酸脂、醛或酮類(lèi)物質(zhì)。此方法操作相對(duì)容易，所需的試驗(yàn)材料相對(duì)較少，但在暗化處理時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法保證測(cè)試所需數(shù)量的雌成蟲(chóng)都是處于求偶狀態(tài)，而每次分析僅能采用較少的腺體數(shù)量，這會(huì)導(dǎo)致樣本內(nèi)沒(méi)有性信息素成分或含量極低，容易導(dǎo)致儀器無(wú)法分析出供試?yán)ハx(chóng)的性信息素成分。

圖7　黃野螟腺體成分的總離子流

3　結(jié)論與討論

3.1黃野螟性信息素的采集方法

黃野螟性信息素提取采用吸附法、溶劑提取法和腺體直接進(jìn)樣法，分別對(duì)吸附法與腺體直接分析法以及吸附法與溶劑提取法GC-MS結(jié)果對(duì)比分析（圖8、圖9）。前2種方法的樣本經(jīng)GC-MS分析后各找到2種引發(fā)雄蛾觸角有電生理反應(yīng)的物質(zhì)，其中1種物質(zhì)在2種方法中均有發(fā)現(xiàn)。腺體直接進(jìn)樣法沒(méi)有從其樣本分析出黃野螟性信息素的疑似成分。溶劑提取法所采集的黃野螟性信息素樣本經(jīng)GC-MS分析，得出163個(gè)可識(shí)別物質(zhì)峰；吸附法得出87個(gè)可識(shí)別物質(zhì)峰。前者所含的雜質(zhì)種類(lèi)較多，GC-MS出峰較為復(fù)雜，物質(zhì)峰分析的工作量大，但其物質(zhì)峰較大，含量較多，又有助于物質(zhì)識(shí)別分析；后者所含的雜質(zhì)較少，物質(zhì)峰分離好，有助于儀器分析和識(shí)別，分析時(shí)工作量較小，且樣品中的物質(zhì)成分與性信息素釋放成分比例較為接近，有利于人工模擬配制其性引誘劑；但由于吸附材料的性質(zhì)不同，難以吸附到全部的性信息素組分。此外，溶劑提取法需要較多的供試?yán)ハx(chóng)樣本，而吸附法所需樣本較少。從2種提取法所得到黃野螟不同性信息素組分來(lái)看，這2種方法對(duì)比各有優(yōu)缺點(diǎn)，互補(bǔ)性強(qiáng)。目前已研究出的昆蟲(chóng)性信息素物質(zhì)主要分為：不飽和醇、醋酸酯、醛或酮類(lèi)物質(zhì)[12]。一般昆蟲(chóng)的性信息素組分包括2種或2種以上物質(zhì)，一種提取方法很難同時(shí)將同一種昆蟲(chóng)的性信息素組分全部提取到。所以在昆蟲(chóng)的性信息素研究中，為了更好地收集昆蟲(chóng)性信息素成分，建議采用2種提取方法。

圖8　吸附法與腺體直接分析法GC-MS分析結(jié)果

圖9　吸附法與溶劑提取法GC-MS分析結(jié)果

3.2黃野螟雌蟲(chóng)性信息素成分的分析

該研究對(duì)信息素粗提物進(jìn)行GC-MS分析，參照已知鱗翅目昆蟲(chóng)的性信息素成分，從GC-MS分析出的性信息素粗提物成分中找出可能的性信息素成分。利用性信息素的3種提取方法進(jìn)行GC-MS分析得到3種黃野螟性信息素疑似成分，其中溶劑提取法獲得的性信息素疑似成分2種，分別為Z8-12：OH和Z7-12：Ac，比例為1：4；吸附法獲得的性信息素疑似成分2種，分別為Z8-12：OH和E8，E10-12：OH，比例為1.6：0.6。其中二者共有1種物質(zhì)Z8-12：OH。腺體直接進(jìn)樣法沒(méi)有檢測(cè)到黃野螟性信息素疑似成分。綜上所述，3種方法發(fā)現(xiàn)黃野螟性信息素疑似組分有3種化合物，分別為E8，E10-12：OH、Z7-12：Ac和Z8-12：OH，其中E8，E10-12：OH也是蘋(píng)果蠹蛾的性信息素成分[13]。今后還需使用GC-EAD技術(shù)對(duì)黃野螟性信息素粗提物進(jìn)行分析，盡可能找出其性信息素組分，同時(shí)驗(yàn)證黃野螟性信息素疑似組分的合理性。最后還需進(jìn)行林間引誘試驗(yàn)，以確認(rèn)等于或超過(guò)活雌蛾及其粗提物誘蟲(chóng)效果的性信息素組分和配比。

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Extraction of Female Adult Sex Pheromone Gland From Heortia vitessoides Moore Using Different Isolation Methods and Identification of Its Compounds by GC-MS

ZHANG Sheng-nan,SHEN Jing,MOU Jing,QIN Wen-quan,LUO Jing,ZHANG Jin-kun,WEN Xiu-jun
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642）

Heortia vitessoides Moore is the most serious pest of Aquilaria sinensis.The research adopted the adsorption method,solvent extraction and glands direct sampling method to obtain the extract from female adult sex pheromone gland. The chemical compositions of the extract were analyzed by GC-MS.The results showed that adsorption method had 87 peak and found two compounds might be the sex pheromone,respectively Z8-12:OH and E8,E10-12:OH;the solvent extraction原method had 163 peak and found two compounds might be the sex pheromone,respectively Z8-12:OH and Z7-12:Ac,but none compound have been found in glands direct sampling method.We compared the difference between different methods. In addition,this study lays a foundation for the insect sex pheromone of Heortia vitessoides Moore.

Heortia vitessoides Moore;Sex pheromone;Extract methods

F433.4

A

1002-3356（2016）03-0001-04

2016-05-11

張勝男（1992-），女，碩士，研究方向：化學(xué)生態(tài)學(xué)和森林昆蟲(chóng)學(xué)。E-mail：2268339633@qq.com。

溫秀軍（1965-），男，博士，教授，研究方向：森林昆蟲(chóng)學(xué)。