VEGF/PDGF相關因子在晚期腎透明細胞癌中的表達與舒尼替尼遠期療效的相關性

李耀輝　馮達天　胡驍軼　王　杭　王國民

(復旦大學附屬中山醫院泌尿外科　上?！?00032)

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VEGF/PDGF相關因子在晚期腎透明細胞癌中的表達與舒尼替尼遠期療效的相關性

李耀輝馮達天胡驍軼△王杭王國民

(復旦大學附屬中山醫院泌尿外科上海200032)

目的觀察晚期腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍化生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)相關因子的表達,并分析其表達量與舒尼替尼遠期療效的相關性。方法選取2010年1月—12月復旦大學附屬中山醫院收治的轉移性晚期腎癌患者20例。所有患者均予患腎根治性切除術,病理證實均為ccRCC。所有患者術后均予舒尼替尼標準給藥方案治療,50 mg每天1次口服,服藥4周、停藥2周為1個療程,每6周隨訪1次,隨訪至2015年12月底。免疫組化方法檢測入組患者病理標本腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF和PDGFR-α、β的表達水平,計算腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD),并與靶向治療遠期療效進行相關性分析。結果截至研究終點日期,所有患者均未出現因不能控制的嚴重不良反應而停藥的情況,存活4人,死亡16人,死亡患者均因腫瘤進展導致。Spearman分析顯示VEGFR-2高表達與較長的無進展生存時間(progression free survival,PFS)及總生存時間(overall survival,OS)存在顯著相關,單因素Cox生存回歸分析中VEGFR-2強陽性與腫瘤進展風險降低(OR=0.162,95%CI:0.031～0.839,P=0.030)及死亡風險降低(OR=0.204,95%CI:0.041～1.015,P=0.052)具有較為顯著的相關性。結論接受舒尼替尼治療的晚期ccRCC患者中,VEGFR-2高表達與較長的PFS及OS存在顯著相關,VEGFR-2強陽性與腫瘤進展風險降低及死亡風險降低顯著相關,提示VEGFR-2有可能成為晚期腎癌靶向治療的遠期療效預測因子。

腎癌;轉移;舒尼替尼;血管內皮生長因子;血小板衍化生長因子

腎細胞癌已經成為泌尿系統最常見的腫瘤之一,嚴重危害著人類生命健康。近10年來,靶向治療藥物的出現使得晚期轉移性腎癌的治療出現了令人鼓舞的改變[1]。它們以血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍化生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)為主要靶標,代表藥物有舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)等,其對晚期轉移性腎癌的療效明顯優于干擾素[2-3]。而臨床上更多的現實情況是,患者使用靶向治療藥物后在短期內腫瘤得到一定控制,但由于腫瘤繼發性耐藥以及腎毒性的出現,其遠期生存仍然不甚理想[4]。因此,尋找晚期腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)對分子靶向藥物治療遠期療效的預測因子,有重要的臨床意義。VEGF及PDGF可激活相應受體從而激活下游信號分子產生一系列生物效應,誘導腫瘤新生血管生成,直接或間接地促進腫瘤細胞的增殖和轉移。舒尼替尼即以VEGF及PDGF為靶標,故VEGF及PDGF可能是潛在的靶向藥物治療遠期療效的預測因子。

本研究回顧性分析2010年1月—12月復旦大學附屬中山醫院收治的晚期腎癌患者20例,檢測其病理標本中腫瘤組織內VEGF和PDGF相關因子的表達水平,并與長期隨訪結果進行相關分析,旨在為晚期ccRCC的分子靶向藥物治療尋找合適的遠期療效預測因子。

資 料 和 方 法

研究對象和給藥方案在復旦大學附屬中山醫院腎癌數據庫中選取2010年1月—12月收治的晚期腎癌患者(Ⅳ期)20例(2010AJCC分期標準)。納入標準:在本院手術并可獲取病理標本;病理證實為ccRCC;至少有1處不可切除且可測量的轉移病灶;在本院進行舒尼替尼靶向治療并接受長期隨訪;均未接受其他抗腫瘤全身性系統治療。入組結果:男性14例,女性6例,中位年齡55歲;所有患者均接受患腎根治性切除手術,術后病理均證實為ccRCC;MSKCC(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)評分均為低中危;所有患者術后予舒尼替尼治療,每6周(1個用藥周期)隨訪1次至2015年12月底隨訪期滿。其中每個周期進行1次安全性評價,每2個周期進行1次有效性評價。舒尼替尼給藥方案為標準的4/2方案[5],50 mg每日1次口服,服藥4周后停藥2周為1個周期。如出現不良反應酌情減量(最高可減至25 mg)或停藥,服藥起始時間一般為術后2～4周,按以上方案給藥至腫瘤進展或出現難以控制的嚴重不良反應。隨訪觀察的時間為2011年1月至2015年12月,隨訪終點為患者死亡或失訪。

療效和評價標準 有效性評價采用實體腫瘤療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors 1.1,RECIST 1.1)評估療效[6]。安全性評價則主要觀察患者的不良反應,不良反應分級按照國際不良反應標準(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events,version 4.0,NCI-CTC 4.0)進行分級[7]。隨訪終點的主要觀察指標為無進展生存期(progression free survival,PFS)及總生存期(overall survival,OS)。

免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)手術切除的腫瘤組織標本按常規方法進行免疫組化染色。相關指標包括VEGF、VEGFC、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF、PDGFR-α、PDGFR-β及腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。染色完成后,用奧林巴斯DP72相機在相同曝光條件下拍照,在高倍視野下,每份標本隨機取5個視野拍攝并保存照片,像素為4 140×3 096。所獲得的圖片用Image Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)軟件進行分析,設置濾過尺寸50像素,根據圖片設置適當的HSI參數,宏操作自動分析圖片,獲得累積光密度值(IOD),為方便計算,定義相對強度=50×IOD/4140/3096。MVD計算:每張照片人工計數血管數目。

結　　　果

腎細胞癌組織的免疫組化檢測結果紅色為細胞質,藍色為細胞核,VEGF及VEGFR顯示為棕色顆粒著色,在細胞膜及細胞質中均有定位(圖1)。PDGF及PDGFR呈棕色顯色,亦見于細胞膜及細胞質,CD34陽性定位于血管內皮細胞的細胞質,呈棕色(圖2)。VEGF相關指標中，以VEGFR-2的強度最高(2.81±1.36);PDGF相關指標中，則PDGFR-2的強度最高(3.33±1.56),平均微血管密度為23.86±11.39(表1)。

腎細胞癌標本各免疫組化指標表達與PFS和OS相關性分析截止隨訪期滿之日,本組患者無一例失訪,且均未出現因不能控制的不良反應而停藥的情況,但已經有16名患者死亡,故本研究中可以對其PFS及OS進行評價。中位隨訪時間為31(7～66)個月。

在PFS、OS與各免疫組化指標的相關分析中,VEGFR-2顯示與PFS(r=0.631,P=0.003)及OS(r=0.477,P=0.033)顯著相關(圖3),而血管MVD與PFS(r=0.405,P=0.095)、OS(r=0.421,P=0.082)之間雖具有一定的相關趨勢,但未達到統計學顯著性。

根據文獻提供的研究方法,把各免疫組化相對強度,以陰性(25%)、弱陽性(50%)、強陽性(25%)的比例進行劃分[8],據此進行Kaplan-Meier生存回歸及Cox生存回歸分析。在Kaplan-Meier生存回歸中,PFS(P=0.042)及OS(P=0.021)在VEGFR-2各組之間差異具有統計學意義 (圖4)。OS在MVD各組之間差異具有統計學意義 (P=0.049),但PFS在MVD各組之間的差異無統計學意義(P=0.061,圖5)。

表1　ccRCC組織免疫組化結果(相對強度)

在Cox生存回歸分析中,根據之前的免疫組化強度分組,以各指標的陰性樣本為參考值,先對各免疫組化指標進行單變量Cox回歸分析,其中P<0.1者進入多變量回歸分析,結果以OR值及其95%CI表示。在單變量Cox回歸分析中,VEGFR-2強陽性表現出與腫瘤進展風險降低具有顯著的相關性(OR=0.162,95%CI:0.031～0.839,P=0.030),VEGFR-2弱陽性與腫瘤進展風險降低雖未達到統計學意義,但具有明顯的相關趨勢(OR=0.330,95%CI:0.102～1.067,P=0.064)。而MVD弱陽性與腫瘤進展風險降低也具有相關趨勢,但未達到顯著的統計學差異(OR=0.379,95%CI:0.124～1.159,P=0.089)。多變量Cox回歸分析則顯示相較于VEGFR-2強陽性(OR=0.150, 95%CI:0.017～1.327,P=0.088)及MVD(OR=0.378,95%CI:0.125～1.145,P=0.085),VEGFR-2弱陽性與腫瘤進展風險降低相關性更加顯著(OR=0.298, 95%CI:0.088～1.010,P=0.052)。在針對OS的單因素Cox回歸分析中,VEGFR-2強陽性(OR=0.204,95%CI:0.041～1.015,P=0.052),VEGFR-2弱陽性(OR=0.348, 95%CI:0.102～1.185,P=0.091)及MVD(OR=0.360,95%CI:0.118～1.096,P=0.072)表現出與死亡風險降低具有相關趨勢,但未達到統計學顯著性(圖6)。多變量Cox回歸分析則顯示VEGFR-2強陽性(OR=0.215,95%CI:0.026～1.806,P=0.157)、VEGFR-2弱陽性(OR=0.355, 95%CI:0.101～1.252,P=0.107)、MVD(OR=0.385, 95%CI:0.127～1.170,P=0.092)雖與死亡風險降低具有相關趨勢,但均未達到統計學顯著性。

隨著科技的進步,小分子靶向藥物治療包括腎癌在內的許多惡性腫瘤已經廣泛應用于臨床并取得了良好的效果[9]。雖然國內外均有研究表明,舒尼替尼對于晚期腎癌的控制具有顯著效果[2-3,10],但在臨床實踐過程中,也會發生原發性和繼發性耐藥[11]。對于晚期腎癌,PDGF及VEGF均與VHL基因密切相關,這兩種生長因子通過與其受體的結合,啟動下游信號通路導致血管內皮細胞增殖及血管生長,并促進腫瘤的增長及浸潤[12]。根據既往的研究及藥理學原理,腫瘤細胞內VEGF及PDGF及其受體等相關分子的表達可能與靶向治療的療效有一定相關性[13]。

在舒尼替尼的擴大臨床試驗中,其意向分析人群的中位OS達到了28.1個月[ 14]。因此,對舒尼替尼遠期療效的觀察,尤其是對長期生存的觀察,需要足夠長的隨訪時間。本研究中的隨訪觀察時間長達5年,完全符合觀察遠期療效的要求。

在免疫組化結果與隨訪結果的相關性分析中,我們發現,在晚期腎透明細胞癌患者中,腫瘤內VEGFR-2與PFS和OS存在顯著相關,而血管MVD與PFS和OS也存在一定的相關性,但未達到統計學意義。總的來說,VEGFR及PDGFR表達水平越高,腫瘤血管更加豐富,腫瘤生長也更快、侵襲性更強,舒尼替尼等小分子靶向藥物治療的效果也將越好,即PFS及OS越長,這也驗證了我們之前的假設。隨后,我們根據測量結果,按照一定方法把患者根據各指標表達強弱,分為陰性、弱陽性及強陽性三組,比較其PFS與OS的差異,發現VEGFR-2在PFS比較上具有顯著的統計學差異。

在單變量Cox回歸分析中,VEGFR-2強陽性顯示與腫瘤進展風險降低及死亡風險降低的顯著相關,即VEGFR-2表達強度越高,腫瘤進展及死亡的風險越低。但是在之后的多變量Cox回歸分析中,其相關的顯著性出現了較明顯的下降,原因可能是在多變量回歸分析中,由于血管MVD這一變量的引入,導致其與VEGFR-2產生相互影響進而降低統計學的顯著性。

在本研究中,我們通過長期的臨床隨訪,初步探討了血管相關因子在腫瘤標本中的表達與靶向治療遠期療效之間的關系。結果提示:VEGFR-2及血管MVD等VHL基因相關指標的高表達與較長的PFS及OS存在較為顯著的相關性,特別是VEGFR-2在生存回歸中顯示出了與PFS與OS的顯著相關性。PDGF相關因子表達與舒尼替尼遠期療效無顯著相關性,這和先前的某些研究結果類似,提示腫瘤靶向治療的相關因素非常復雜。因此,臨床選擇小分子靶向藥物治療患者時,可以根據其腫瘤組織中相關基因表達的情況進行篩選,當然這僅是決策依據之一。這方面已經有越來越多的分子標記被提出并驗證[15-19]。

VEGFR-2等VHL基因相關指標的高表達與較長的PFS及OS存在相關性,其中尤以VEGFR2的意義更大。在小分子靶向藥物治療腎細胞癌的臨床實踐中,這有可能成為其遠期療效的預測因子,但需要更大樣本的前瞻性研究驗證。

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E-mail:hu.xiaoyi@zs-hospital.sh.cn

The relationship between VEGF/PDGF expression and prospective efficacy of sunitinib in metastatic renal cell carcinoma

LI Yao-hui, FENG Da-tian, HU Xiao-yi△, WANG Hang, WANG Guo-min

(DepartmentofUrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

ObjectiveTo explore the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet-derived growth factor(PDGF),and their relationship with prospective efficacy of tyrosine kinase inhibitor sunitinib in metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC).MethodsTwenty patients with histologically proven metastatic ccRCC were selected between Jan., 2010 and Dec., 2010.All patients underwent radical nephrectomy and then were followed up to Dec.,2015.All patients received a standard regimen of sunitinib (a dose of 50 mg given orally once daily for 4 weeks on and 2 weeks off,6 weeks per cycle).Tissue microarrays from primary tumor specimens of all patients were

kidney neoplasm;metastasis;sunitinib;vascular endothelial growth factor;platelet-derived growth factor

R737.11

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.006

2016-01-10;編輯:王蔚)

復旦大學附屬中山醫院青年科研啟動基金(ZH2010-385)

immunohistochemically stained for selected markers,including PDGF,PDGFR-α,β,VEGF-A,VEGF-C and VEGFR-2,3.And the results of immunohistochemistry (IHC) and microvessel density(MVD) were compared with patients′ survival.ResultsTo the date of statistical analysis,16 patients died of tumour progression.High expression of VEGFR-2 was significantly correlated with the longer progression free survival (PFS) and overall survival (OS) in Spearman correlation analysis.Cox regression analysis revealed that a strong positive of VEGFR-2 was significantly associated with both lower risk of tumor progressing(OR=0.162,95%CI:0.031-0.839,P=0.030) and lower mortality risk(OR=0.204,95%CI:0.041-1.015,P=0.052).ConclusionsFor ccRCC patients who treated with sunitinib,high expression of VEGFR-2 was significantly correlated with the longer PFS and OS,while a strong positive of VEGFR-2 was significantly associated with both lower risk of tumor progressing and lower mortality risk.VEGFR-2 could be a predictive factor for making a clinical decision in RCC targeted therapy.

*This work was supported by Youth Scientific Research Project of Zhongshan Hospital,Fudan University(ZH2010-385).