棗類黃酮化合物的快速提取方法

張 瓊　周廣芳　王中堂　單公華　劉孟軍　劉 平*

(1 山東省果樹研究所， 山東 泰安 271000)(2 河北農業大學中國棗研究中心， 河北 保定 071001)

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棗類黃酮化合物的快速提取方法

張 瓊1,2周廣芳1*王中堂1單公華1劉孟軍2劉 平2*

(1 山東省果樹研究所， 山東 泰安 271000)(2 河北農業大學中國棗研究中心， 河北 保定 071001)

針對棗類黃酮化合物提取中存在的耗時長、含糖量高等問題，以“魯棗1號”為試材，采用紫外分光光度計和高效液相色譜進行棗類黃酮化合物的快速提取方法研究。本研究從提取質量、化合物數量、提取時間等多方面綜合比較溶劑超聲浸提法、融凍微波破壁法和簡化QuEChERS法的提取效果，確定棗類黃酮化合物的快速提取方法。研究表明：簡化QuEChERS法可在30 min內有效提取棗類黃酮。具體步驟為：樣品加水渦旋5 min，然后加乙腈振蕩15 min，最后加NaCl離心分層，取上層乙腈相。整個過程歷時30 min，可有效去除部分糖類物質。該方法簡單、快速、有效。

棗；類黃酮；簡化QuEChERS法；快速提取

棗(Ziziphus jujuba Mill.)是原產中國的具有極高的食用、藥用、經濟、生態和科研價值的樹種，是我國第一大干果樹種，其產量占世界棗總產量的99%以上，因此其開發與利用占有絕對的市場優勢。

棗中除含有豐富的多糖、維生素、膳食纖維、環磷酸腺苷等功能物質，還含有豐富的類黃酮類物質[1-4]。類黃酮具有很強的抗氧化、清除自由基能力，具有抗癌、抗衰老、抗炎、改善心腦血管脆性等生理功能，其中一些類黃酮化合物已被批準用作醫藥品，例如蘆丁已是一種毛細血管脆性及靜脈曲張狀態的治療藥物。另外，類黃酮對植物體本身也有一定的調節作用，可以作為酶抑制劑、對植物有害的金屬的螯合劑以及還原劑等[5]。因此，充分開發與利用類黃酮，尤其是占世界總產量99%的棗中的類黃酮，具有重要的現實意義與廣闊的發展前景。

開發棗類黃酮首先要明確棗中含有的類黃酮物質種類，常采用高效液相色譜與質譜對提取液進行分離鑒定，目前棗類黃酮的提取方法有有機溶劑提取法、超聲波提取法、融凍微波破壁提取法等，但棗中的糖含量很高，以上方法提取出的類黃酮提取液中含有大量的可溶性糖等雜質，且耗時長，不利于進一步的檢測。因此，需要建立一種簡單、高效、快速的除雜、利于檢測的提取方法。

QuEChERS是近年來國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術，其步驟簡單歸納為樣品粉碎→乙腈提取分離→鹽析除水→吸附劑除雜→上清液檢測。該方法具有操作簡單、精確度和準確度高等優點，在農殘檢測中被廣泛應用。

本文以自主選育品種“魯棗1號”為試材，借鑒QuEChERS樣品前處理方法，并對其進行簡化用于提取棗類黃酮化合物，并比較簡化QuEChERS法與超聲波提取及融凍微波破壁提取效果，旨在為棗類黃酮的開發與利用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料為自主選育的極早熟優良品種“魯棗1號”，于2014年8月5日采于山東省果樹研究所棗資源圃，選取成熟度一致、大小均勻的果實，采后帶回實驗室，用水沖去果面浮塵，削成1 mm薄片，液氮速凍后研磨成粉末狀，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2棗類黃酮提取的不同方法

1.2.1超聲波提取法

稱取棗樣品1 g，加入20 mL 60%乙醇水溶液，超聲提取40 min，離心取上清液，重復1次。

1.2.2融凍微波破壁提取法

稱取棗樣品1 g，加入20 mL 40%乙醇水溶液，置于-20℃冰箱中冷凍，至溶液完全凍結，取出，低火微波提取2min，離心取上清液，殘渣重復凍結微波提取1次。

1.2.3簡化QuEChERS提取法

稱取棗樣品1 g，加入10 mL蒸餾水，渦旋1 min后加入20 mL乙腈，超聲提取10 min，加入3. 6 g氯化鈉，搖勻靜置，10 000轉/分離心取上清液，重復提取1次，合并兩次的上清液，得待測液。

1.3類黃酮含量的測定

以蘆丁為標準品，采用硝酸鋁比色法進行含量測定。取1 mL待測液置于10 mL試管中，加入5%亞硝酸鈉水溶液0. 3 mL，搖勻，靜置5 min，再加入10%硝酸鋁水溶液0. 3 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液4. 0 mL，搖勻，用30%乙醇水溶液定容至刻度，靜置15 min后，于波長500nm處測定其吸光度，計算其含量。

1.4HPLC的檢測條件

提取液過0. 22 μm微孔濾膜，進行HPLC檢測。檢測條件參考張瓊(2010)[6]的方法，具體為：HPLC(安捷倫1200)，反向C18色譜柱(LiChroCART，250×4. 6 mm i.d.)，柱溫30 ℃，流動A為乙腈，流動相B為1%甲酸水溶液，梯度洗脫。

1.5數據分析

不同提取方式提取出的類黃酮含量的比較采用Excel 2007進行分析。

2　結果與分析

2.1提取效率的比較

本試驗共采用3種方法提取棗類黃酮，分別為簡化QuEChERS提取法、超聲波提取和融凍微波破壁提取，第一種提取方法是借鑒農殘檢測前處理方法QuEChERS法，將其進行簡化，其余兩種方法較常用。圖1為3種提取方式提取出來的類黃酮物質的含量比較，以超聲波提取的類黃酮含量最高，為2. 54 mg/g，簡化QuEChERS提取的類黃酮含量最低，為2. 28 mg/g，但經方差分析三者未見明顯差異，說明簡化QuEChERS法法與其它兩種常用方法提取量相當，但該方法的提取時間較其它方法明顯減少，僅需30 min。融凍微波破壁提取過程微波提取所需時間雖然較少，但需先將樣品冷凍，此過程較為耗時。

圖1　簡化QuEChERS法、超聲波提取法、融凍微波破壁提取法提取類黃酮含量比較

2.2色譜分離效果比較

因融凍微波破壁提取法與簡化QuEChERS法提取到的棗黃酮醇含量相當，而提取總用時較簡化QuEChERS法多，因此色譜分離效果比較試驗中只對簡化QuEChERS法和提取量最高的超聲提取法獲得的提取液進行了HPLC檢測，比較其分離效果。如圖2所示，在相同液相條件下，均可在兩種方法的提取液中檢測到8種類黃酮物質，但超聲波提取液在HPLC檢測中雜峰較多，而簡化QuEChERS法提取液檢測到的雜峰很少，說明后一種方法提取更有利于棗類黃酮的提取分離分析。

圖2　超聲波提取和簡化QuEChERS法提取所得樣品提取液的高效液相色譜圖

3　討論與結論

棗的含糖量非常高，鮮棗含糖量幅度在13. 0%～35. 03%[7]，而干棗含糖量可達80. 86%～85. 63%，在類黃酮提取過程中，部分糖類物質得以析出，對類黃酮的提取分離影響很大。而本試驗中提到的簡化QuEChERS法是基于鹽析液-液萃取技術的一種提取方法，是指在可與水混溶的有機溶劑的水溶液中加入鹽，利用目標分析物和糖類雜質在水相和有機相中的溶解度不同，鹽析可使提取液分相，將目標分析物萃取到有機相中，達到快速分離純化的目的。目前，類似原理的類黃酮提取方法已在金銀花、銀杏等植物上得以應用，效果理想[8,9]。

用乙腈-水混合溶液作為提取劑，可使棗中的類黃酮與可溶性糖等物質在短時間內有效分離，提純待測液，且提取劑與色譜、質譜流動相相匹配，不會出現明顯的試劑峰，利于成分分離與鑒定。具體步驟為：樣品加水渦旋5 min，之后加乙腈振蕩15 min，最后加NaCl離心分層，取上層乙腈相即得棗類黃酮提取液。簡化QuEChERS法可在30 min內有效提取棗類黃酮，簡單、快速、有效，是一種利于分離鑒定檢測的快速提取棗類黃酮的方法。但鑒于乙腈的毒性，該方法不適用于生產，非常適用于實驗室進行物質的快速分離與鑒定及其他相關試驗。

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[5]唐傳核. 植物生物活性物質[M]. 北京：化學工業出版社，2005：218-249.

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[7]郭裕新，單公華. 中國棗[M]. 上海：上海科技出版社，2010.

[8]李萍. 一種基于固相提取技術的銀杏葉制劑分析樣品快速制備方法[P]. 中國，N103323558B.2014-12-10.

[9]余順火. 從葛根廢棄料中快速提取葛根異黃酮的方法[P]. 中國，CN102961436A. 2013-03-13.

A Rapid and Efficient Extraction Method of Flavonoids from Ziziphus jujuba Fruits

Zhang Qiong1,2Zhou Guangfang1*Wang Zhongtang1Shan Gonghua1Liu Mengjun2LiuPing2*

(1 Shandong Institute of Pomology, Taian, Shandong 271000) (2 Research Center of Chinese Jujube, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071001)

The objective of this study was to develop a simplified and rapid procedure for flavonoids extraction from jujube fruits. Flavonoids were extracted from the ripe edible fruits of jujube(Ziziphus jujuba ' Luzao 1' )using three methods, which were ultrasonic extraction, microwave-frozen-melted disintegrating method and simplified QuEChERS method. The extraction effects were comprehensively evaluated from quantity, quality and time by Uv-vis spectrophotometry and high-performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the simplified QuEChERS method was optimal. Detailed procedures were as follows: the grinded jujube fruits in liquid nitrogen were eluted by water for 5 minutes, and then acetonitrile was added to oscillate for 15 minutes. After oscillation, NaCl was added to the extracts. By centrifugal separation, the extracts were turned into two layers, the upper acetonitrile layer contained all the flavonoids. The entire procedure can be carried out in approximately 30 minutes, and effectively eliminate some saccharide. The simplified QuEChERS method is easy, rapid and efficient.

Ziziphus jujuba Mill; flavonoids; simplified QuEChERS method; rapid extraction

2015-08-02

山東省農業良種工程(2014LZ12);山東省果樹研究所所長基金(2013KY01);山東省農業科學院青年科研基金(2014QNM34)。

張瓊(1982-)，女，在讀博士，助理研究員，研究方向為棗品種選育及營養研究。E-mail：qiong1982@163.com

?E-mail：gkskyb@sina.com

1009-0568(2016)03-0037-04

S662.9

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.03.007