羅漢松實多糖含量測定方法研究＊

龐逸敏，林彩琴，潘嬌紅，蔣偉哲，黃增瓊

（廣西醫科大學藥學院，廣西南寧530021）

羅漢松實多糖含量測定方法研究＊

龐逸敏，林彩琴，潘嬌紅，蔣偉哲，黃增瓊

（廣西醫科大學藥學院，廣西南寧530021）

目的建立測定羅漢松實多糖含量的紫外分光光度法。方法采用超聲輔助提取法提取多糖，以葡萄糖為對照品，采用硫酸-苯酚比色法測定羅漢松實中多糖的含量，紫外檢測波長為490 nm。結果葡萄糖質量濃度在20～100 μg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系，回歸方程為Y=0.008 0 X-0.015 8，r=0.998 0(n=5），平均回收率為101.64%，RSD為4.77%(n=6)。羅漢松實多糖平均含量為4.74 mg/g(以葡萄糖計)。結論該方法操作簡單，重現性好，結果準確、可靠，可用于羅漢松實多糖含量的測定。

羅漢松;多糖;含量測定;超聲輔助提取

羅漢松實為羅漢松科植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don的果實，又名土杉，產自我國長江以南地區，目前在我國有4個變種，多為庭園觀賞樹，在廣西北海已有較大規模種植，每年可產出大量的羅漢松果實。羅漢松果實由種子和花托組成，其花托部分可當作水果直接食用，具有補腎益肺、治血虛面色萎黃和心胃痛的功效［1］。種子有補中益氣、祛風除濕的功效，根皮能活血、止痛、殺蟲［2］;葉子能止血，可用于咳血、吐血［1］。Park等［3-5］從羅漢松葉中分離得到了羅漢松內酯和羅漢松二萜等十幾種成分。目前，對羅漢松葉的化學成分研究報道較多，但羅漢松果實的研究國內外均未見報道。多糖作為一類重要的生物大分子物質，具有抗癌、抗氧化、抗病毒、調節免疫等生物活性［6-7］。筆者采用超聲輔助提取法［8］對羅漢松實中的多糖進行了提取，并采用Dubois等［9］提出的硫酸-苯酚比色法測定了羅漢松實多糖的含量，為羅漢松果實的藥效學研究及開發利用提供依據。現報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

1.2試藥

羅漢松實鮮品采自廣西北海，經廣西醫科大學藥學院生藥學教研室朱丹博士鑒定，為羅漢松科植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don的果實。葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為110833-201205);無水乙醇、95%乙醇、苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1溶液制備

2.1.15%苯酚試劑

準確稱取苯酚5.0 g，加水溶解，置100 mL棕色容量瓶中定容，得5%苯酚試劑，于4℃冰箱保存備用。

2.1.2葡萄糖標準溶液

精確稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品0.100 0 g，加水溶解，置100 mL容量瓶定容，配制成質量濃度為1 g/L的葡萄糖溶液，精密量取10 mL，定容至100 mL，得質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液［10］。

2.1.3供試品溶液

面對自貿園區可能給自由貿易協定帶來的貿易偏移等消極影響，大部分自由貿易協定采取了將自貿園區法律制度納入其規則體系的應對措施。具體而言，自由貿易協定應對自貿園區挑戰的根本方法是不再承認自貿園區貨物可同時疊加享有自由貿易協定的減免稅收待遇，從而將自貿園區貨物與區域貿易貨物拉回到相近的競爭“起跑線”。通常，自由貿易協定會限制或禁止自貿園區貨物以免稅的方式流通進自由貿易協定成員國，自貿園區貨物需要在出口市場繳納相應的進口稅，或不承認自貿園區給予非區域進口零件或裝備所享受的國內稅收優惠。但各個自由貿易協定采取的方式及審查標準并不相同。

粗多糖的提取:準確稱取羅漢松實100 g，加120 mL無水乙醇回流1 h，趁熱濾除溶劑，重復2次。濾渣用95%乙醇潤洗3次，每次20 mL，加水400 mL，超聲(功率60%，300 W)提取30 min，80℃水浴再提取60 min，趁熱過濾。重復提取2次，合并濾液并濃縮至10 mL。濃縮液加4倍量無水乙醇，置4℃冰箱中過夜后3 000 r/min離心20 min，沉淀物用無水乙醇、丙酮洗滌至無色，得粗多糖［11］。

Sevage法脫蛋白［12］:粗多糖加40 mL蒸餾水溶解，加入Sevage試劑正丁醇∶氯仿（1∶5，V/V），震蕩30 min，5 000 r/min離心15 min，收集多糖溶液并定容至100 mL容量瓶中，得供試品溶液。

2.2測定波長選擇

精密吸取供試品溶液1.0 mL，置具塞試管，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，快速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，30℃水浴中保溫20 min，靜置10 min，以蒸餾水同法操作為空白，于460～510 nm波長處測定吸光度，確定最大吸收波長為490 nm。

2.3方法學考察

標準曲線繪制［13］:分別精密量取質量濃度為0.1 g/L的葡萄糖標準溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置具塞試管，分別加水至1 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻。快速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，30℃水浴中保溫20 min，靜置10 min，以1.0 mL蒸餾水加入1 mL苯酚和5 mL濃硫酸為空白，于490 nm波長處測定各管吸光度。以葡萄糖質量濃度(X)為橫坐標、吸光度(Y)為縱坐標制繪制標準曲線，得回歸方程Y= 0.008 0X-0.015 8，r=0.998 0（n=5)。結果表明，葡萄糖質量濃度在20～100 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。標準曲線見圖1。

圖1　標準曲線圖

精密度試驗:精密量取葡萄糖標準溶液0.5 mL，按2.1.3項下方法操作，于490 nm波長處測定吸光度，平行測定6次。結果的RSD為0.21%(n=6)，表明儀器精密度良好。

顯色穩定性試驗:精密量取供試品溶液2 mL，按2.1.3項下方法操作，490 nm波長處測定吸光度，分別于0，30，60，90，120，150，180 min時測定吸光度。結果的RSD為1.25%(n=7)，表明供試品溶液在3 h內穩定。

重復性試驗:精密量取供試品溶液6份，每份1 mL，按2.1.3項下方法操作。結果吸光度的RSD為3.31% (n=6)，表明方法重現性良好。

加樣回收試驗:精密量取已知質量濃度的羅漢松實多糖溶液0.5 mL，分別加入質量濃度為0.1 g/L的葡萄糖標準溶液0.25 mL及蒸餾水0.25 mL，按2.1.3項下方法操作，平行測定6次，測定吸光度并計算回收率。結果見表1。

表1　加樣回收試驗結果（n=6）

2.4樣品含量測定

取羅漢松實2份，按2.1.3項下方法操作，精密量取供試品溶液1 mL，依法測定吸光度，每份測定3次，代入標準曲線計算葡萄糖的質量濃度。含量計算公式為:多糖含量(mg/g)=CDV/W，其中C為樣品中葡萄糖質量濃度(g/L)，D為樣品溶液的稀釋倍數，V為多糖溶液的體積(mL)，W為樣品質量(g)。結果羅漢松實多糖平均含量為4.74 mg/g(以葡萄糖計)，RSD為2.73%。結果見表2。

表2　樣品多糖含量測定結果

3　討論

多糖含量的測定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法、Somogyi-Nelon法等多種方法。本試驗是利用多糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成羥甲基糠醛，羥甲基糠醛與苯酚縮合成有色化合物，該化合物顏色深淺與糖的濃度成正比。方法簡便，且供試液在3 h內顯色穩定，重現性較好，但要注意除去單糖、醇溶性蛋白等干擾性成分。

本試驗中，在進行多糖樣品提取時，先用無水乙醇回流除去脂溶性成分和色素，再用Sevage法除去蛋白，可排除樣品中雜質的干擾。采用蒸餾水對花托中的色素進行提取并進行光譜掃描，發現色素于490 nm波長處無吸收，可排除色素對測定結果的干擾。

采用本法測定羅漢松實鮮品多糖含量時，要將花托充分搗爛，否則所測得含量結果偏差較大。

本試驗以葡萄糖標準品為對照，用紫外分光光度法測定羅漢松實中多糖含量，得出羅漢松實多糖的含量為4.74 mg/g(以葡萄糖計)。該方法操作簡單，重現性好，結果準確可靠，具有實際應用價值，可測定羅漢松實多糖的含量，為羅漢松實的質量控制和資源開發提供科學依據。

［1］江蘇新醫學院.中藥大辭典［M］.上海：上海科學技術出版社，1977：1 360-1 361.

［2］肖培根，連文琰.中藥植物原色圖鑒［M］.北京:中國農業出版社，1999：30.

［3］Park HS，Takahashi Y，Fukaya H，et al.S-R-Podolactone D，a new sulfoxide-containing norditerpene dilactone from Podocarpus macrophyllus var.maki［J］.Journal of Natural Products，2003，66（2）：282-284.

［4］Park HS，Yoda N，Fukaya H，et al.Rakanmakilactones A-F，new cytotoxic sulfur-containing norditerpene dilactones from leaves of Podocarpus macrophyllusvar.maki［J］.Tetrahedron，2004，60（1）：171-177.

［5］Park HS，Kai N，Fukaya H，et al.New cytotoxic norditerpene dilactones from leaves of Podocarpus macrophyllus var.maki［J］. Heterocycles，2004，63（2）：347-357.

［6］方金紅.多糖化學修飾方法的研究進展［J］.中國藥業，2014，23（19）：4-8.

［7］尹艷，高文宏，于淑娟.多糖提取技術的研究進展［J］.食品工業科技，2007(2)：248-250.

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［11］李粉玲，蔡漢權，林曼莎.超聲波提取草莓多糖的工藝研究［J］.江西化工，2013（3）：66.

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［13］羅傲雪，范益軍，羅傲霜，等.不同提取方法對石斛多糖含量測定的影響［J］.中國藥房，2010，21(7)：601-602.

Content Determination of Podocarpus Macrophyllus

Pang Yimin，Lin Caiqin，Pan Jiaohong，Jiang Weizhe，Huang Zengqiong
（College of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi，China533021）

ObjectiveTo determine the polysaccharides content of fruit from Podocarpus macrophyllus.MethodsThe ultrasonic-assisted extraction method was used to extract polysaccharides from the fruit ofPodocarpus macrophyllus and the polysaccharides content was determined by sulphuric acid-phenol colorimetric method，with glucose as

ubstance.The UV detection wavelength was 490 nm.ResultsGlucose absorbance showed a good linear relationship with the content in the range of 20-100 μg/mL.The regression equation is Y=0.008 0 X-0.0158，r=0.998 0（n=5），and the average recovery rate was 101.64%，RSD=4.77%（n=6）.The average content of polysaccharides inPodocarpus macrophyllus is 4.74 mg/g（according to glucose）.ConclusionThis determination method is simple to be operated，with good reproducibility，and the results are accurate and reliable，which can be used to determine the polysaccharides content of Podocarpus macrophyllus.

Podocarpus macrophyllus；polysaccharides；content determination；ultrasonic-assisted extraction

R284.1;R282.71

A

1006-4931（2016）13-0022-03

龐逸敏（1991-），女，漢族，廣西玉林人，碩士研究生，研究方向為神經藥理學，(電子信箱) PYMPYMPYM1219@163.com;黃增瓊（1979-），壯族，廣西南寧人，博士研究生，副教授，研究方向為中藥民族研究與開發，本文通訊作者，（電話）0771-5352512。

2016-01-10;

2016-02-07）

＊廣西南校中青年教師基礎能力提升項目，項目編號:KY2016YB096;廣西南寧市生物制藥產業大型科學儀器與設備共享與服務平臺建設—廣西醫科大學共享平臺建設，項目編號:20121052-1。