老龍皮多糖分離純化及糖組成研究

張　紅，孫婷婷，王海峰，劉建峰

(1.陜西省中醫藥研究院，陜西西安710003;2.武警工程大學醫院，陜西西安710086)

老龍皮多糖分離純化及糖組成研究

張紅1，孫婷婷1，王海峰2，劉建峰1

(1.陜西省中醫藥研究院，陜西西安710003;2.武警工程大學醫院，陜西西安710086)

目的分離純化老龍皮多糖，并對其糖組成進行測定。方法采用冷水浸提、75%乙醇沉淀、離子交換和凝膠過濾等方法分離純化老龍皮多糖，采用PMP衍生法及高效液相色譜法測定其糖組成。結果對老龍皮多糖進行了系統分離，得到5個組分，即LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5，并對含量較高的LKY1和LKY2進行進一步分離和糖組成測定。結論初步分離純化得到5種均一性多糖，并確定其中兩種的糖組成，為老龍皮多糖的結構研究提供了一定的研究基礎。

老龍皮;多糖;糖組成

老龍皮為子囊地衣類Ascolichenes茶漬目Lecanorales牛皮葉科Stictaceae肺衣屬Lobaria Hoffm植物光肺衣Lobaria kurokauae Yoshim.、裂芽肺衣Lobariaisidiosa Vaim.和網肺衣Lobaria retigera Trev.的干燥葉狀地衣體，主要生長于巖石表面、樹干基部及樹皮上，分布于秦嶺北坡等地，是陜西部分地區民間常用中藥材，具有利水健脾、祛風止癢的功效，臨床主要用于治療小兒疳積、腹脹等，以及水腫、燙傷、無名腫毒、皮膚瘙癢等［1-9］。多糖類化合物是維持生物體正常生理功能所必須的能量來源，同時也是參與生物體中的各類細胞生物活動的活性物質。因此，多糖類藥物的活性與結構研究受到越來越多研究者的關注。老龍皮中含有大量多糖［10］，但有關研究報道較少，本課題旨在通過對老龍皮多糖的提取分離純化及糖組成研究，為老龍皮的開發利用作前期的基礎研究工作。

1　儀器與試藥

1.1儀器

高速組織搗碎機(上海標準模型廠);T-214型精密電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司);超低溫冷凍干燥器(丹麥);Sorvall RC5C plus型高速低溫冷凍離心機(美國Sorvall公司)。

1.2試藥

老龍皮采自陜西省寶雞市紅河谷地區。經陜西省中醫研究院中藥鑒定室楊智峰教授鑒定為肺衣屬Lobaria Hoffm植物光肺衣Lobaria kurokauae Yoshim.的干燥葉狀地衣體。葡萄糖(批號20140630)、葡萄糖醛酸(批號140648-201403)、甘露糖(批號140651-201403)、阿拉伯糖(批號111506-200001)、半乳糖醛酸(批號111646-200301)、鼠李糖(批號111683-20041)、木糖(批號111508-200404)、半乳糖(批號100226-201105)對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院; PMP(sigma公司，批號101337108);Sephadex G-100 (Pharmacia進口分裝產品)。磷酸二氫鈉、過氧化氫、冰醋酸、苯酚、硫酸鈉、正丁醇、氯化鈉、濃硫酸、無水乙醇、氫氧化鈉等均為分析純。

2　方法與結果

2.1老龍皮粗多糖（LKY）的提?。?1-12］

將400 g老龍皮于烘箱中50℃烘干，粉碎，加冷水浸提2次，每次12 h，提取液過100目紗布，高速離心機離心，過濾，濾液減壓濃縮，加入95%乙醇，使含醇量達75%，靜置過夜，過濾，取沉淀反復用75%乙醇清洗2～3遍，蒸餾水溶解，采用Sevage法脫蛋白(THMS∶nbutanol=4∶1)，置振蕩器上震蕩20 min，離心，取上清液，再加入Sevage試劑適量，重復操作7～8次，至蛋白完全去除后將樣品裝入透析袋，對水透析2～3 d，取出，冷凍干燥，得到LKY。

2.2老龍皮多糖的分離純化

2.2.1離子交換柱層析

稱取LKY樣品1 g，置試管中，加蒸餾水10 mL溶解，離心，取上清液過離子交換層析柱(填料為DEAE-52，50 cm×6 cm)，依次用水和0.05，0.1，0.25，0.5 mol/L NaHCO3溶液洗脫，分部收集流出液。待洗脫完全后，用苯酚-硫酸法在490 nm波長處隔管檢測吸光度值，以吸光度值繪制多糖和蛋白的洗脫曲線，并根據洗脫曲線合并各組分，對水透析，減壓濃縮，冷干，備用。

2.2.2凝膠過濾柱層析

取上述樣品100 mg加蒸餾水2 mL溶解，過G-100凝膠過濾色譜柱進一步分離，以蒸餾水洗脫。

2.2.3分離純化

取400 g老龍皮藥材，粉碎后采用冷水浸提法提取2次，合并提取液，減壓濃縮至400 mL，加95%乙醇，使含醇量達75%，靜置過夜，過濾。所得沉淀反復用75%乙醇清洗2～3遍，再將沉淀加水100 mL，復溶，Sevage法脫蛋白7～8次，再對流水透析2 d后，取出，凍干，得到黃棕色水提LKY。經采用DEAE-52陰離子交換樹脂柱進行分離后得到5個組分:LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5。再取含量較高的LKY1和LKY2，加蒸餾水制成50 g/L的溶液。采用Sephadex G-100凝膠過濾柱(80cm×1.2cm)，流動相為蒸餾水，流速為0.6mL/min，每管4 mL，得到LKY1-A和LKY2-A。洗脫曲線圖見圖1。

2.3單糖組成測定［13］

2.3.1溶液制備

對照品溶液:精密稱取阿拉伯糖2.12 mg，甘露糖2.14 mg，半乳糖醛酸2.27 mg，葡萄糖醛酸1.93 mg，半乳糖1.8 mg，木糖1.87 mg，鼠李糖1.85 mg，葡萄糖1.88 mg，分別置5 mL容量瓶中，用蒸餾水配成2 mmol/L的水溶液，制成單糖對照溶液;將單糖對照品各取800 μL，加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液800 μL及0.3 mol/L NaOH 800 μL，在QT-2旋渦混合器上震蕩10 min;70℃水浴中反應40 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 800 μL進行中和，并加入去離子水1 600 μL稀釋混勻。用1 mL氯仿萃取3次，靜置分層后吸取上層衍生溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

圖1　LKY1和LKY2經Sephadex G-100凝膠過濾柱層析的洗脫曲線圖

供試品溶液:取樣品2 mg，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸在121℃水解2 h，蒸干，加入5 mL氨水溶解。取200 μL與200 μL PMP/甲醇溶液混合，加入200 μL 0.3 mol/L NaOH在QT-2型旋渦混合器上振勻，于70℃水浴鍋中加熱反應40 min，冷卻至室溫，再加入200 μL 0.3 mol/L HCl進行中和，加去離子水400 μL，稀釋混勻，再用1 mL氯仿萃取3次，靜置分層后吸取上層衍生溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.2色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相:15%乙腈(A)+0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH= 6.9，B)-40%乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH= 6.9)，梯度洗脫，見表1;流速:1 mL/min;柱溫:25℃。

表1　梯度洗脫條件

2.3.3測定結果

測定結果表明，LKY1-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸組成，相對摩爾比為6∶25∶18∶1; LKY2-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸組成，相對摩爾比為3∶15∶8∶1。色譜圖見圖2。

圖2　高效液相色譜圖

3　討論

老龍皮中含有大量的蛋白質，蛋白質的存在會干擾糖結構檢測結果，因此須將蛋白質去除。Sevage法［14］脫蛋白是采用氯仿、正丁醇等有機溶劑使蛋白轉變為變性蛋白，進而分離多糖，操作簡便，不破壞多糖結構。多糖粗提取多采用冷水浸提、熱水提取、加酸提取、加堿提取等方法，采用冷水浸提不會對多糖結構造成破壞，因此本試驗采用熱水浸提法提取LKY。

離子交換技術是分離多糖的常用技術，可以有效除去多糖中的蛋白質和色素等，并對多糖進行初步分級，本試驗中采用DEAE-52對老龍皮多糖進行初分，得到5個組分:LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5。凝膠過濾技術是分離大分子化合物的常用方法，本試驗中采用葡聚糖凝膠G-100層析柱對組分LKY1和LKY2進行細分離，分離效果良好，得到兩種均一性多糖LKY1-A和LKY2-A。

PMP作為一種重要的衍生化學試劑，可以在溫和條件下(70℃，反應30 min)與糖鏈的還原端發生反應，并且不會導致糖鏈脫唾液酸化，且產物無立體異構體，并在245 nm波長處有最強紫外吸收。糖鏈經PMP衍生后，極性減弱，可用高效液相色譜法檢測［15］，因此采用這種方法測定單糖組成。

綜上，對老龍皮多糖進行了系統分離，得到5個組分:LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5，并對含量較高的LKY1和LKY2進行進一步分離，確定其糖組成為:LKY1-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸組成，相對摩爾比為6∶25∶18∶1;LKY2-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸組成，相對摩爾比為3∶15∶8∶1。

［1］李世全.秦嶺巴山藥物志［M］.西安：陜西科學技術出版社，1987：777.

［2］中國藥科大學.中藥辭海（第一卷）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，1993：1 899.

［3］杜遠東.老龍皮的藥效物質及質量標準研究［D］.西安:陜西中醫學院，2012.

［4］王曉梅，李健，李宗孝，等.老龍皮提取物的體外抗氧化活性研究［J］.現代中醫藥，2010，30(5)：79-80.

［5］尹娜，張琪，牛慶慧，等.中藥復方逆轉胃癌前病變的臨床研究［J］.齊魯醫學雜志，2011，26(4)：314-315.

［6］王啟林，房敏峰，胡正海.太白山藥用地衣的種質資源及其化學成分的研究概況［J］.中國野生植物資源，2011，30(4)：1-6.

［7］史雪.《中華本草》收載具有利水功效藥物的藥性規律研究［D］.青島:山東中醫藥大學，2013.

［8］李志東，王慧，張海娟，等.老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮的影響［J］.中國藥房，2015，26(4)：463-466.

［9］賈萍.指紋圖譜與中藥質量控制［J］.中國藥業，2004，13(2)：79-80.

［10］靳菊情，丁東寧，邊曉麗，等.老龍皮多糖的研究［J］.中藥材，1997，20(7)：355-357.

［11］庹康秀，廖共山，胡仁統，等.可口革囊星蟲多糖的提取及含量測定［J］.中國藥業，2013，22(4)：18-19.

［12］張捷，黃榮花，張書華.標準曲線法測定茯神中多糖的含量［J］.中國藥業，2013，22(16)：15-16.

［13］方金紅.多糖化學修飾方法的研究進展［J］.中國藥業，2014，23(19)：4-8.

［14］Bradford MM.A rapid，and sensitive method for the quantification of protein using the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976(72)：48-54.

［15］李薇，夏晴，孫成榮，等.柱前衍生(PMP)-HPLC法測定不同品種甘草多糖中單糖組成［J］.遼寧中醫藥大學學報，2014，16（1）：56-58.

Isolation and Structural Characterization of Polysaccharides from Lobaria Kurokauae Yoshim.

Zhang Hong1，Sun Tingting1，Wang Haifeng2，Liu Jianfeng1
（1.Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Xi'an，Shaanxi，China 710003；2.Engineering University of CAPF，Xi'an，Shaanxi，China710086）

ObjectiveTostudytheisolation，purification，monosaccharidecharacterizationofpolysaccharideobtainedfromLobaria kurokauae Yoshim.MethodsThe polysaccharides was extracted from the Lobaria kurokauae Yoshim.with cold water，75%ethanol precipitation and then purified by DEAE-cellulose ion exchange chromatography and Sephadex G-100 gel filtration chromatography；its monosaccharide composition was detected by PMP-derivative method combined with HPLC.ResultsThe crude polysaccharide（LKY）obtained from Lobaria kurokauae Yoshim.was fractionated into 5 sub-fractions by DEAE-cellulose ion exchange chromatography，designated as：LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5.The polysaccharides，termed LKY1-A and LKY2-A was extracted respectively from LKY1 and LKY2 by Sephadex G-100 gel filtration chromatography.Conclusion5 kinds of polysaccharides are obtained by the preliminary isolation and purification，and the monosaccharide of two of them is confirmed，which provides a foundation for the further structural study of Lobaria kurokauae Yoshim.

Lobaria kurokauae Yoshim.；polysaccharides；monosaccharide composition

TQ461;R284.1;R282.71

A

1006-4931（2016）13-0040-04

張紅，博士研究生，副主任藥師，研究方向為中藥質量標準，(電子信箱)zhanghong919919@ 163.com;劉建峰，大學本科，研究員，研究方向為中藥質量標準，本文通訊作者，(電子信箱)13032910828@ 126.com。

2016-02-10;

2016-03-16）