丙泊酚對脂多糖誘導的小膠質細胞腫瘤壞死因子-α表達的影響

馮社軍　王慧娟　武艷強　李軍濤

(邯鄲市中心醫院神經內科，河北　邯鄲　056001)

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丙泊酚對脂多糖誘導的小膠質細胞腫瘤壞死因子-α表達的影響

馮社軍王慧娟武艷強1李軍濤

(邯鄲市中心醫院神經內科，河北邯鄲056001)

目的探討丙泊酚能否通過抑制核因子(NF)-κB活化下調脂多糖(LPS)誘導的小膠質細胞腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達。方法將BV2細胞分為4組即對照組、丙泊酚組、丙泊酚+LPS組和LPS組。在干預0 h和24 h時使用MTT法檢測BV2細胞活性。在干預24 h后使用RT-PCR法和Western印跡法對BV2細胞TNF-α mRNA和蛋白的表達水平進行檢測；并使用Western印跡法對細胞NF-κB p65磷酸化水平(phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值)進行分析。結果在給予LPS干預24 h后BV2細胞活性明顯降低(P均<0.05)；但丙泊酚+LPS組細胞活性較LPS組增加(P均<0.05)，同時對照組和丙泊酚組細胞活性無統計學差異(P均>0.05)。與對照組相比較，在LPS干預24 h后BV2細胞TNF-α mRNA和蛋白的表達水平以及phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明顯升高(P均<0.05)；但LPS組較丙泊酚+LPS組TNF-α表達的升高以及phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值的增加更加顯著(P均<0.05)；同時對照組和丙泊酚組TNF-α表達水平和phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值無統計學差異(P均>0.05)。結論丙泊酚可能通過抑制NF-κB的激活下調了BV2細胞TNF-α合成和釋放。

丙泊酚；BV2細胞；腫瘤壞死因子-α；核因子-κB

炎癥反應在腦卒中導致的神經元損傷過程中扮演著重要的角色〔1～4〕。小膠質細胞作為神經組織中主要的固有免疫細胞，是腦卒中相關炎癥反應的最重要的參與者和效應細胞。過度活化的小膠質細胞可大量釋放一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6等炎癥介質和部分神經毒性物質，直接導致神經元壞死和誘導神經元的凋亡，同時還可使血管內皮細胞通透性增加導致腦水腫的發生〔5～7〕。基礎研究發現該過程與核因子(NF)-κB的活化密切相關〔6～8〕，而有研究表明丙泊酚可通過抑制NF-κB活化減輕炎癥反應〔9，10〕。故本文探討丙泊酚能否通過抑制NF-κB活化下調脂多糖(LPS)誘導的小膠質細胞TNF-α表達。

1　材料與方法

1.1主要試劑和材料PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司；丙泊酚購買于英國阿斯利康公司；兔抗鼠TNF-α抗體、兔抗鼠NF-κB p65抗體、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗體和兔抗鼠β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；DMEM培養基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，MTT試劑盒(美國Promega公司)，超純水。其余試劑均為分析純。

1.2細胞培養小膠質BV2細胞常規接種在含10%胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37℃、95%空氣、5%CO2孵箱內培養。每48 h換液、傳代2次，取對數生長期細胞用于實驗。BV2細胞分為照組、丙泊酚組、丙泊酚+LPS組和LPS組。其中對照組細胞加入PBS；LPS組和丙泊酚+LPS組加入LPS (1 μg/ml)；丙泊酚+LPS組和丙泊酚組加入50 μmol/L的丙泊酚溶液進行干預。

1.3細胞活性分析(MTT比色試驗)取對數生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96 孔培養板中，每孔接種100 μl約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養細胞16～24 h，使細胞同步化。使用MTT比色試驗對0 h和24 h時的細胞生長狀態進行測定，重復實驗4次。細胞活性(%)=OD干預組/OD對照組×100%〔11〕。

1.4細胞TNF-α mRNA表達檢測干預24 h后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：TNF-α正義5′-AAATTCGAGTGACAAGCCTGTAG-3′，反義5′-GAGAACCTGGGAGTAGACAAGGT-3′和β-actin正義：5′-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3′，反義：5′-GTCACGCACGATTCCC-TCT-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉錄和擴增實驗。應用凝膠成像系統(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用與β-actin PCR產物條帶灰度比值作為TNF-α mRNA的相對表達量。

1.5Western印跡法檢測細胞中TNF-α蛋白表達和NF-κB p65活化水平干預24 h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗鼠TNF-α抗體(1∶700)、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗體 (1∶800)、 兔抗鼠NF-κB p65抗體(1∶800)和兔抗鼠β-actin抗體(1∶1 200)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.6統計學方法采用SPSS17.0統計學軟件進行單因素方差分析。

2　結　果

2.1細胞活性分析在給予LPS (1 μg/ml)干預24 h后BV2細胞活性明顯降低(P均<0.05)；但丙泊酚+LPS組細胞活性較LPS組增加(P均<0.05)，同時對照組和丙泊酚組細胞活性無統計學差異(P均>0.05)。見表1。

表1　MTT比色法測定BV2細胞活性

與對應時點對照組比較：1)P<0.05；對應時點LPS組比較：2)P<0.05

2.2TNF-α mRNA和蛋白的表達與對照組比較，BV2細胞在LPS干預后TNF-α mRNA和蛋白的表達水平明顯升高(P均<0.05)。但LPS組較丙泊酚+LPS組TNF-α mRNA和蛋白的表達升高更加顯著(P均<0.05)，同時發現對照組和丙泊酚組TNF-α表達水平無統計學差異(P均>0.05)。見圖1和表2。

1～4：對照組、丙泊酚組、丙泊酚+LPS組、LPS組，下圖同圖1　BV2細胞TNF-α表達的RT-PCR和Western印跡結果

2.3NF-κB p65活化水平與對照組相比較，BV2細胞在LPS干預后phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平明顯升高(P均<0.05)。但LPS組較丙泊酚+LPS組phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平升高更加顯著(P均<0.05)，同時發現對照組和丙泊酚組phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平無統計學差異(P均>0.05)。見圖2和表2。

表2　BV2細胞TNF-α mRNA和蛋白的表達水平及NF-κB p65活化水平

與對照組比較：1)P<0.05；與LPS組比較：2)P<0.05

圖2　BV2細胞NF-κB p65活化的Western印跡結果

3　討　論

由于動脈粥樣硬化、原發性高血壓、糖尿病和心房顫動等慢性疾病的發病人數持續增多，缺血性和出血性腦卒中發病率也明顯上升〔1～4，12〕。目前認為急性腦梗死治療的主要目的之一是改善缺血半暗帶潛在可挽救的缺血的腦神經組織和細胞，防止繼發性損害的產生。小膠質細胞分布于中樞神經系統，數量約占神經膠質細胞總數的5%～10%，其體積最小，在腦組織中廣泛分布，以海馬、嗅葉和基底神經節處分布最為豐富，丘腦和下丘腦次之，腦干和小腦數量最少。一般狀況下小膠質組胞處于靜息和休眠狀態。當腦卒中發生時小膠質細胞迅速活化，從靜止的分支樣轉變為活化的阿米巴樣的形態，大量的表面分子迅速上調，包括CD14、主要組織相溶細胞(MHC)、趨化因子受體和其他一些活化標記分子〔5～7，13，14〕。

目前大量的研究發現丙泊酚具有獨立于鎮靜鎮痛以外的炎癥抑制作用〔15～18〕。Peng等〔16〕的研究發現丙泊酚可以有效抑制LPS誘導的膠質細胞的炎癥反應。Ma等〔18〕的研究也證實丙泊酚對LPS誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷有保護作用。同時由于TNF-α作為體內最重要的促炎癥介質在包括腦卒中在內的多種炎癥性疾病中發揮重要的生物學作用，研究發現神經組織中TNF-α可直接和間接地誘導小膠質組胞活化，并促進其吞噬功能，同時還可促進其他炎癥介質的釋放和導致腦組織中血管內皮細胞的損傷和通透性的增加〔19，20〕。抑制和下調TNF-α可以有效改善腦卒中導致的炎癥反應，改善預后。本研究結果表明丙泊酚具有抑制炎癥狀態下BV2細胞TNF-α合成和釋放的作用。

NF-κB在包括腦卒中導致的炎癥反應等多種炎癥過程中扮演著極為重要的角色。非激活狀態下NF-κB以非磷酸化的形式存在于細胞質中；在炎癥和應激等狀態下NF-κB迅速磷酸化形成二聚體，并核轉位與具有κB結合序列的靶基因結合導致轉錄活性的增加。同時TNF-α轉錄活性調節區存在κB結合序列，NF-κB是TNF-α最重要的轉錄調節因子之一。Li等〔15〕研究發現在間歇性缺氧狀態下丙泊酚可以通過選擇性抑制NF-κB的活化抑制MAPK p38信號通路減輕人血管內皮細胞的損傷。同時Hsing等〔17〕也證實丙泊酚有效地減輕了LPS誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥反應和氧化應激，并發現該過程與下調NF-κB活化密切相關。本研究結果表明丙泊酚可有效抑制LPS誘導的BV2細胞NF-κB的活化水平。

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〔2015-02-16修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

河北省衛生廳重點科技研究計劃(20130359)

李軍濤(1972-)，男，碩士，主任醫師，主要從事腦血管病研究。

馮社軍(1980-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事腦血管病研究。

R39

A

1005-9202(2016)18-4407-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.002

1邯鄲市中心醫院心血管內科