梔子水提物和醇提物對糖尿病小鼠并發抑郁癥的防治

王君明　段佩利　師燕然　李　晴　張月月　崔　瑛

(河南中醫藥大學藥學院，河南　鄭州　450046)

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梔子水提物和醇提物對糖尿病小鼠并發抑郁癥的防治

王君明1段佩利師燕然李晴張月月崔瑛1

(河南中醫藥大學藥學院，河南鄭州450046)

目的探討梔子水提物(ZZST)和80%乙醇提取物(醇提物，ZZCT)防治糖尿病并發抑郁癥的作用機制。方法雄性昆明小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥MH-FH〔鹽酸二甲雙胍(MH，100 mg/kg)、鹽酸氟西汀(FH，10 mg/kg)聯合用藥〕、ZZST低、中、高劑量(102、204、408 mg/kg)和ZZCT低、中、高劑量(73、146、292 mg/kg)，連續灌胃(ig)給藥21 d，1次/d，末次給藥后1 h進行糖水消耗實驗(SCT)、開場實驗(OFT)、強迫游泳實驗(FST)和血糖測試；高效液相色譜法(HPLC)測定梔子提取物中梔子苷含量。結果與正常組比較，模型組小鼠血糖水平顯著升高、糖水偏愛顯著降低、游泳不動時間顯著增加、OFT運動時間和站立次數顯著降低；與模型組比較，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和MH-FH均可使以上異常指標顯著改善，ZZST(204、408 mg/kg)和ZZCT(292 mg/kg)均與MH-FH相比無顯著差異；ZZST和ZZCT中梔子苷含量分別為206.8 mg/g和207.1 mg/g。結論梔子提取物ZZST和ZZCT均具有防治糖尿病并發抑郁癥作用，且與陽性藥MH-FH作用相當；梔子苷可能為梔子防治糖尿病并發抑郁癥作用的物質基礎之一。

梔子；梔子苷；糖尿病；抑郁癥；糖水偏愛；強迫游泳實驗；開場實驗

糖尿病并發抑郁癥是糖尿病常見并發癥之一，國外文獻報道，糖尿病病人有60%～75%伴有抑郁情緒，其中10%～35%為重度抑郁〔1，2〕。就糖尿病而言，沉重的精神壓力、不良情緒不僅會使血糖升高、降低治療的依從性，還會加速心、腎等并發癥的發生，對預后不利。反之，血糖控制不好、病情加重又會導致病人精神痛苦、悲觀等，加重抑郁癥狀。重度抑郁癥還會引起悲觀和絕望，甚至出現自殘和自殺行為。本研究旨在考察梔子提取物防治糖尿病并發抑郁癥的作用，并比較其水提物和乙醇提取物作用的差異。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物昆明(KM)小鼠，雄性，SPF級，體質量18～22 g，由河南省實驗動物中心提供〔SCXK(豫)2010-0002〕。

1.1.2試藥梔子：鄭州市張仲景大藥房，產地江西，批號150101，經河南中醫藥大學藥學院生藥學科陳隨清教授鑒定確認為茜草科梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實；梔子苷：上海金穗生物科技有限公司，批號：20130314，純度>98%；鹽酸二甲雙胍片：上海信宜藥廠有限公司，批號48140908；鹽酸氟西汀：常州四藥制藥有限公司，批號20130701；鏈脲佐菌素(STZ)：Sigma，批號20150225；蔗糖(分析純)：津致遠化學試劑有限公司，批號2014111061；枸櫞酸(分析純)：天津致遠化學試劑有限公司，批號：20150201；氫氧化鈉(分析純)：天津市恒興化學試劑制造有限公司，批號20140723；生理鹽水：河南太龍藥業股份有限公司，批號13012152；血糖試紙：江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，魚躍。

1.1.3儀器高效液相色譜儀：美國Waters公司，e2695；UV/visible Detector：美國Waters公司，Waters2489；十萬分之一分析天平：上海海康電子儀器廠，AB145S；色譜柱：德國邁克，C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；血糖儀：江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，魚躍710，悅準TMI型；大小鼠開場活動實驗系統：成都泰盟軟件有限公司，OFT-100；旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司，EYELA，N-1100；TDL-40B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；BS210S型電子天平：北京塞多利斯天平有限公司；XK96-B快速混勻器：姜堰市新康醫療器械有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1梔子提取物制備梔子水提物(ZZST)：采用梔子飲片粗粉，每1 g梔子粗粉加6 ml水(W/V=1∶6)，回流提取2次，每次1 h，4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收水至浸膏，60℃減壓干燥，稱重，4℃保存待用。ZZST得率為20.4%。梔子醇提物(ZZCT)：采用梔子飲片粗粉，每1 g梔子粗粉加6 ml的體積分數為80%的乙醇(W/V=1∶6)，回流提取2次，每次1 h，4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收乙醇至浸膏，60℃減壓干燥，稱重，4℃保存待用。ZZCT得率為14.6%。

1.2.2高效液相色譜法(HPLC)測定梔子提取物中梔子苷含量

1.2.2.1色譜條件Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2489 紫外/可見光檢測器，德國邁克Reprosil-Pur Basic C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇：水(35∶65)，檢測波長：238 nm；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；進樣量：10 μl。

1.2.2.2對照品溶液制備及標準曲線的繪制精密稱取梓醇對照品9.47 mg，加流動相(甲醇∶水=35∶65)制成每1 ml含947 μg的對照品溶液儲備液(用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取續濾液作為儲備液)，將該貯備液用流動相等比稀釋至一系列濃度(7.4、14.8、29.6、59.2、118.4、236.8、473.5 μg/ml)的對照品溶液，儲備液及各稀釋液按1.2.2.1色譜條件進樣，以對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標線性回歸，繪制標準曲線，記錄相關系數r值。

1.2.2.3供試品溶液制備及含量測定分別精密稱取ZZST 20.4 mg和ZZCT 14.6 mg，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，精密量取上清液10 ml，用甲醇定容至25 ml，用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取續濾液，按照1.2.2.1中色譜條件進樣，依據標準曲線計算梔子提取物供試品中梔子苷含量。梔子苷含量以mg/g提取物計。

1.2.3動物處理及血糖測試用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.2)配制STZ注射液，小鼠在禁食16 h后(不禁水)一次性腹腔注射(ip) STZ (150 mg/kg)造糖尿病模型〔3〕；造模后小鼠經過72 h的自由飲食后，于尾靜脈取血，用血糖儀測定血糖值(血糖>11.1 mmol/L為糖尿病模型制作成功)，篩選血糖值>11.1 mmol/L的小鼠再予慢性不可預知溫和應激(CUMS)〔4〕，每天隨機給予一種應激，CUMS主要包括夾尾3 min(距尾尖1 cm)、禁水24 h(8：00～8：00)、潮濕飼養24 h(將200 ml水加入有鋸末的籠底，24 h)、禁食24 h(8：00～8：00)、束縛(5 min)、搖晃(1次/s，15 min)和冷水(8℃)游泳7 min；陽性藥(MH-FH)采用鹽酸二甲雙胍(MH，100 mg/kg)和鹽酸氟西汀(FH，10 mg/kg)聯合用藥(ig給藥)，受試ZZST低、中、高劑量(102、204、408 mg/kg，分別相當于梔子原藥材臨床等效劑量的1、2、4倍劑量)和ZZCT低、中、高劑量(73、146、292 mg/kg，分別相當于梔子原藥材臨床等效劑量的1、2、4倍劑量)，模型組和正常組僅ig給予等量溶媒(0.5%CMC-Na)，其中正常組不給予造模而模型組造模，兩組均不給予受試藥物。每天CUMS的同時，給予各受試藥物或溶媒，連續21 d，末次給藥后1 h進行行為學測試。行為學測試結束后，立即尾靜脈取血，測試血糖值。陽性藥及各受試藥物均用0.5% CMC-Na溶解或混懸至所需給藥濃度。

1.2.4糖水消耗試驗(SCT)小鼠于實驗前24 h訓練適應含糖飲水，在禁食禁水12 h后進行SCT。測試時，所有小鼠單籠飼養，在安靜的房間進行，每籠即每只小鼠放兩個水瓶(內分別裝入清水和1%蔗糖水，體積均為100 ml，兩水瓶位置隨機放置)，2 h后取走水瓶并測量體積(測試前后瓶中水量之差)，測定2 h內小鼠1%蔗糖水攝入體積及清水攝入體積，按公式計算每只動物的糖水偏愛。糖水偏愛=〔糖水攝入體積/(糖水攝入體積+清水攝入體積)×100%〕。

1.2.5開場試驗(OFT)采用大小鼠開場活動實驗系統OFT-100進行實驗。實驗時將小鼠放入中心方格內，記錄小鼠在5 min內的運動距離和站立次數。

1.2.6強迫游泳實驗(FST)〔5〕將小鼠單獨放入高20 cm、直徑14 cm的圓柱形玻璃缸中，缸內水深10 cm，水溫(25±2)℃，從小鼠入水后計時6 min，記錄后4 min內游泳累計不動時間(指小鼠在水中停止掙扎，或顯示漂浮狀態，僅有微小的肢體運動以保持頭部浮在水面)。

1.3統計學方法應用SPSS11.5軟件，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD法。

2　結　果

2.1梔子提取物中梔子苷含量測定結果實驗獲得的標準曲線為：y=14 054x-7 597.1，其中x指梔子苷濃度(μg/ml)，y指峰面積，相關系數r=1，線性范圍為0.074～4.735 μg；含量測定結果顯示，ZZST中梔子苷含量為206.8 mg/g提取物，ZZCT中梓醇含量為207.1 mg/g提取物。

2.2梔子提取物對各組小鼠血糖的影響與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)，表明STZ造糖尿病模型成功。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽性藥MH-FH均可使高血糖小鼠血糖水平顯著降低(P<0.05)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比均無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.3梔子提取物對各組小鼠糖水偏愛的影響與正常組比較，模型組小鼠糖水偏愛顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽性藥MH-FH均可使高血糖小鼠糖水偏愛顯著升高(P<0.05)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.4梔子提取物對各組小鼠強迫游泳不動時間的影響與正常組比較，模型組小鼠FST游泳不動時間顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽性藥MH-FH均可使小鼠FST不動時間顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.5梔子提取物對各組小鼠OFT中運動時間和站立次數的影響與正常組比較，模型組小鼠在OFT運動時間和站立次數均顯著降低(均P<0.01)。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽性藥MH-FH均可使小鼠OFT運動時間和站立次數顯著升高(P<0.05)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比無明顯差異(P>0.05)；此外，ZZST低劑量(102 mg/kg)亦可顯著升高小鼠OFT的站立次數(P<0.05)。見表2。

表1　梔子提取物對糖尿病并發抑郁癥小鼠血糖、糖水偏愛、FST不動時間的影響

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2　梔子提取物對糖尿病并發抑郁癥小鼠OFT運動時間和站立次數的影響

3　討　論

糖尿病引發的高血糖使機體器官和組織代謝紊亂，甚至會累及中樞神經系統，誘發精神癥狀出現。糖尿病患者飲食受限、生活質量下降更易引發抑郁等負面情緒，終而導致糖尿病并發抑郁癥。再者，抑郁癥患者缺乏運動且飲食不規律，服藥依從性差，更加不利于糖尿病的治療。二者之間的相互影響，加大了糖尿病抑郁癥的治療難度。

梔子具有清心除煩和清三焦郁火之良效，具有降糖解郁理論基礎。研究結果已表明，梔子提取物具有降糖〔6〕和抗抑郁作用〔7〕。本研究結果顯示，STZ引起了小鼠血糖顯著升高，進一步通過CUMS引起了小鼠的抑郁樣行為，如糖水偏愛降低(反映抑郁癥的核心癥狀——興趣缺乏和快感缺失)、游泳不動時間增加(反映抑郁癥主要癥狀——行為絕望)、OFT運動時間(反映水平活動能力)和站立次數(反映垂直活動能力)降低(反映抑郁癥主要癥狀——情緒低落)等，綜合提示小鼠糖尿病抑郁癥模型復制成功；給予ZZST、ZZCT和陽性藥MH-FH 3 w后，過高血糖被顯著降低、糖水偏愛顯著升高、游泳不動時間顯著減少、OFT運動時間和站立次數均顯著升高，且ZZST和ZZCT與MH-FH各指標相比均無明顯差異，綜合提示ZZST和ZZCT均具有防治糖尿病并發抑郁癥的作用，且與MH-FH作用相當。

依據梔子苷含量測定結果，如果將梔子提取物的劑量折合至對應梔子苷的劑量，那么ZZST的劑量102、204和408 mg/kg分別相當于梔子苷的劑量為21、42和84 mg/kg；同樣，ZZCT的劑量73、146和292 mg/kg分別相當于梔子苷的劑量為15、30和60 mg/kg。依據本實驗中ZZST和ZZCT的藥理實驗結果不難看出，作用強弱與梔子苷絕對量(折合劑量)的多少呈現明顯正相關。如糖水偏愛實驗結果中，ZZST低、中、高劑量(102、204和408 mg/kg)均明顯提高了高血糖小鼠的糖水偏愛且呈現出明顯的劑量依賴關系，一定程度上，可以認為隨著梔子苷絕對量的增加，對糖水偏愛的升高作用增加；同樣的分析結果亦可在本研究的其他幾個實驗中得到印證。因此，梔子苷可能為梔子防治糖尿病并發抑郁癥的重要物質基礎之一。

1Perveen S，Otho MS，Siddiqi MN，etal.Association of depression with newly diagnosed type 2 diabetes among adults aged between 25 to 60 years in Karachi，Pakistan〔J〕.Diabetol Metab Syndr，2010；2(1)：17.

2Derakhshanpour F，Vakili MA，Farsinia M，etal.Depression and quality of life in patients with type 2 diabetes〔J〕.Iran Red Crescent Med J，2015；17(5)：e27676.

3楊巍，羅春元，于春雷，等.不同劑量STZ誘導小鼠糖尿病模型的發病機制〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2006；32(3)：432-5，543.

4王亞軍，張瑜，田永萍，等.針藥結合治療對慢性應激抑郁模型大鼠行為學的影響〔J〕.中醫研究，2008；21(11)：12-5.

5Porsolt RD，Bertin A，Jalfre M.Behavioral despair in mice：a primary screening test for antidepressants〔J〕.Arch Int Pharmacodyn Ther，1977；229(2)：327-36.

6Chen YI，Cheng YW，Tzeng CY，etal.Peroxisome proliferator-activated receptor activating hypoglycemic effect of Gardenia jasminoides Ellis aqueous extract and improvement of insulin sensitivity in steroid induced insulin resistant rats〔J〕.BMC Complement Altern Med，2014；14(1)：30.

7Tao W，Zhang H，Xue W，etal.Optimization of supercritical fluid extraction of oil from the fruit of Gardenia jasminoides and its antidepressant activity〔J〕.Molecules，2014；19(12)：19350-60.

〔2016-01-04修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of extracts from water and ethanol of Gardenia jasminoides Ellis on diabetes complicated with depression

WANG Jun-Ming,DUAN Pei-Li,SHI Yan-Ran,et al.

Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,Henan,China

ObjectiveTo investigate the effects of extracts from water and ethanol of Gardenia jasminoides Ellis(GJ) on diabetes complicated with depression.MethodsMale mice were divided into normal,model control,MH-FH as positive control,low,middle and high doses of water extract of GJ (ZZST),and low,middle and high doses of 80% ethanol extract of GJ (ZZCT).Mice were treated with MH-FH,ZZST,ZZCT or solvent 0.5% CMC-Na everyday for 21 continuous days by intragastric administration (ig).Mouse sugar consumption test (SCT),forced swim test (FST),open field test (OFT) and blood glucose test (BGT) were used to observe the preventive effects on diabetes complicated by depression of ZZST and ZZCT,respectively,at 1 h after the last administration.Besides,high performance liquid chromatography (HPLC) was used to measure the contents of geniposide in ZZST and ZZCT.ResultsCompared with those of normal group,blood sugar and immobility time of FST were significantly increased,and sucrose preference,moving time and standing times were all significantly decreased.Compared with those of model group,above abnormal parameters were all significantly ameliorated by ZZST,ZZCT and MH-FH.The contents of geniposide in ZZST and ZZCT were 206.8 and 207.1 mg/g,respectively.ConclusionsZZST and ZZCT exert preventive effects on diabetes complicated with depression equal to MH-FH.Geniposide might be one of the main bioactive compounds of GJ in prevention on diabetes complicated with depression.

Gardenia jasminoides Ellis;Geniposide;Diabetes;Depression;Sucrose preference;Forced swim test;Open field test

國家自然科學基金青年科學基金項目(81503269)；河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目(2014GGJS-072)；鄭州市科技攻關計劃項目(20150309)；河南中醫學院省屬高校基本科研業務專項人才培養項目(2014KYYWF-QN01)

王君明(1980-)，男，博士，博士后，副教授，主要從事中藥藥性藥效作用機理及新藥研發。

R28

A

1005-9202(2016)18-4410-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.003

1河南中醫藥大學呼吸病診療與新藥研發河南省協同創新中心