6 w高強度跑臺運動對大鼠關節軟骨和關節滑液中基質金屬蛋白酶-1、-3和-9的影響

劉紹東　張彥秋

(西安石油大學體育系，陜西　西安　710065)

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6 w高強度跑臺運動對大鼠關節軟骨和關節滑液中基質金屬蛋白酶-1、-3和-9的影響

劉紹東張彥秋

(西安石油大學體育系，陜西西安710065)

目的探討高強度跑臺運動對大鼠關節軟骨和關節滑液中基質金屬蛋白酶(MMP)-1、-3、-9的影響。方法選取30只雌性SD大鼠，隨機分成對照組和高強度運動組，每組15只，其中高強度運動組進行6 w高強度跑臺運動。6 w后處死所有動物，取大鼠膝關節滑液以及股骨內側髁軟骨組織，HE染色觀察軟骨病理學改變；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠關節滑液中MMP-1、-3和-9蛋白的含量；Western印跡以及實時定量PCR法觀察軟骨組織中MMP-1、-3、-9蛋白和mRNA的表達。結果高強度運動組大鼠明顯出現軟骨損傷，并且關節滑液中MMP-1、-3、-9的蛋白水平明顯高于對照組(P<0.05)；關節軟骨中MMP-1、-3、-9的蛋白和mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05)。結論高強度運動可導致關節軟骨損傷；而關節滑液和關節軟骨中MMP-1、-3、-9的高表達很可能是高強度運動致關節軟骨損傷的機制之一。

高強度運動；軟骨損傷；基質金屬蛋白酶；骨關節炎

高強度運動可以引起關節軟骨的損傷，繼而導致骨性關節炎(OA)的發生，給人們帶來極大心理和經濟負擔〔1〕。研究表明，基質金屬蛋白酶(MMP)-1、-3、-9在軟骨損傷中發揮重要作用〔2〕。本實驗利用跑臺運動研究MMP-1、-3、-9是否在高強度運動引起的軟骨損傷中發揮作用。

1　材料與方法

1.1實驗對象及分組3月齡雌性SD大鼠30只(購于西安交通大學醫學院實驗動物中心)，體重(330±25)g；均飼養于西安交通大學醫學院實驗動物中心，自由攝食飲水，動物房溫度維持在18℃～22℃，濕度維持在40%～60%，每日明暗時間均為12 h；所有動物在本實驗前均未參加過跑臺運動。

所有大鼠在適應性喂養1 w后開始在跑臺上適應性運動訓練3 d，跑臺坡度為0°，速度為10 m/min，適應性訓練時間為1次/d，10 min/次。高強度運動組大鼠(n=15)在適應性訓練結束后休息2 d；然后根據Bedford等〔3〕的研究確定運動強度。正式跑臺的坡度為0°，初始速度為10 m/min，并且在10 min內速度逐漸增加至28 m/min，并維持60 min。按照此運動方法1次/d，每周運動5 d，連續6 w。對照組大鼠(n=15)在籠內飼養，不參加跑臺運動。所有動物6 w處死取材。

1.2蘇木素-伊紅(HE)染色取5只大鼠的左側股骨內側髁軟骨組織，4%多聚甲醛固定、常規脫鈣、石蠟包埋，4 μm連續切片。HE染色后置于光學顯微鏡下觀察(×200)，每個組織均取1張切片，每張切片分別取3個不同視野觀察軟骨組織的病理學改變。

1.3RT-PCR分析每組選取5只大鼠，取其股骨內側髁軟骨組織，利用Trizol 試劑盒提取軟骨組織總RNA，并反轉錄成cDNA。用SYBR Green 1 PCR mix試劑和ABI7300 實時定量PCR擴增儀進行擴增測定分析，并以軟骨組織內β-actin的mRNA水平作為對照，利用2-△△Ct的方法進行各組基因表達的分析。引物序列見表1。

表1　實時定量PCR引物序列

1.4Western印跡分析每組選取5只大鼠，取其股骨內側髁軟骨組織，RIPA裂解液提取總蛋白，加入上樣緩沖液，95℃靜置10 min，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，上樣量為20 μl/孔，電泳結束后將目的蛋白轉移到PVDF膜上。室溫條件下5 g/100 ml脫脂牛奶封閉2 h，加入MMP-1、MMP-3和MMP-9抗體(Abcam，美國)，4℃過夜。加入二抗室溫孵育2 h，用化學增強發光法(ECL)發光試劑在暗室中行X線膠片曝光。β-actin作為內參對照。采用Image Pro圖像分析軟件進行灰度定量分析。

1.5酶聯免疫吸附(ELISA)法按照ELISA試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)的說明書，取適量大鼠膝關節液檢測膝關節滑液中MMP-1、-3、-9蛋白表達水平。

1.6統計學方法應用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2　結　果

2.1軟骨HE染色結果對照組關節軟骨表面光滑，表層細胞排列整齊、緊密，細胞核完整；各層細胞層次清楚，結構完整，軟骨基質染色均勻，軟骨基質內未見增生血管。高強度運動組軟骨表面不再光滑，存在潰瘍缺損和小的裂隙，細胞層次排列紊亂，并有簇集現象，軟骨細胞整體減少，并且在軟骨內可見灶性溶解、壞死。見圖1。

圖1　各組關節軟骨HE染色結果(×200)

2.2關節滑液MMP-1、-3、-9的表達干預6 w后，高強度運動組關節滑液中MMP-1、-3、-9的表達(22.00±4.74、13.00±2.92、22.80±3.71)均明顯高于對照組(14.80±3.89、8.00±2.24、16.60±2.30，P<0.05)。

2.3軟骨MMP-1、-3、-9 mRNA表達干預6 w后，高強度運動組膝關節軟骨中MMP-1、-3、-9的mRNA表達(1.90±0.32、2.30±0.45、2.12±0.35)均明顯高于對照組(1.06±0.27、0.84±0.21、1.08±0.31，P<0.05)。

2.4軟骨MMP-1、-3、-9蛋白表達干預6 w后，高強度運動組膝關節軟骨中MMP-1、-3、-9蛋白的表達〔(73.00±10.65)%、(75.44±14.26)%、(75.80±11.95)%〕均明顯高于對照組〔(30.80±6.49)%、(35.00±9.19)%、(31.40±10.86)%，P<0.05〕。見圖2。

圖2　各組關節軟骨MMP-1、-3、-9蛋白的表達

3　討　論

運動訓練是增強運動員身體素質的主要途徑，但是高強度的以及不恰當的運動會造成不同程度的機體損傷。在眾多運動損傷中，關節軟骨損傷較為常見〔2〕，并且關節軟骨損傷后修復比較困難，其主要原因與軟骨內血管、神經分布較少有關；因此，損傷早期及時有效的治療對于關節軟骨損傷的預后具有重要意義，若治療不恰當或不及時會加速關節軟骨蛻變，進而出現OA等慢性關節損傷性疾病。雖然對于軟骨損傷目前臨床中有較多的治療方案，但是療效不是很明顯，這很可能是由兩個原因造成的：①軟骨組織中缺乏血管、神經等營養支持，損傷后難以自我修復；②目前對于高強度運動引起的軟骨損傷的具體發病機制還不明確，導致缺乏針對性強的治療方案。

軟骨損傷是軟骨合成和降解的失衡，而軟骨基質主要由Ⅱ型膠原和蛋白聚糖組成。MMPs是降解軟骨基質的重要的蛋白酶，所以MMPs表達的異常必然是軟骨損傷的重要機制。研究發現MMP-1、-3、-9降解軟骨基質的主要MMPs〔2〕。MMP-1已被證明可以降解關節軟骨中Ⅱ膠原〔4〕，并且軟骨分泌的MMP-1可以被立即分泌到關節滑液中，并彌散到關節軟骨上，進一步造成關節軟骨的破壞〔5〕。研究還表明MMP-1可以通過激活腫瘤壞死因子-α等炎癥因子，從而加速關節軟骨的破壞〔6〕。

MMP-3同樣在關節軟骨基質降解的過程中發揮重要作用。研究發現MMP-3可以降解蛋白聚糖、纖維連接素、層連蛋白、彈性蛋白等，并且可以激活MMP-1降解Ⅱ型膠原，最終使關節軟骨抵抗外力的作用下降，進而導致關節軟骨的損傷〔2〕。研究表明，血清MMP-3的增加與關節軟骨的損傷呈正相關〔7〕，而阻斷軟骨中MMP-3的表達有利于軟骨損傷的修復〔8〕。這些研究都說明MMP-3的表達在軟骨損傷中起著重要作用。MMP-9同樣是關節軟骨基質降解的重要的蛋白酶。在損傷的關節軟骨中，MMP-9的表達明顯增高〔9〕。在類風濕關節炎的損傷軟骨中，學者們同樣觀察到MMP-9的表達較正常對照組明顯增高〔10〕。這些研究足以證明MMP-9在關節軟骨基質降解的過程中發揮了不可替代的作用。

本實驗應用跑臺運動制成功制造出了高強度運動軟骨損傷模型，并且進一步證明了MMP-1、-3、-9在高強度運動軟骨損傷中的作用，為以后治療關節軟骨遠動損傷提供了新的思路。

1于國輝.關節軟骨運動損傷修復中的骨形態發生蛋白〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2010;14(46):8669-72.

2Ding L,Guo D,Homandberg GA,etal.A single blunt impact on cartilage promotes fibronectin fragmentation and upregulates cartilage degrading stromelysin-1/matrix metalloproteinase-3 in a bovine exVivo model 〔J〕.J Orthop Res,2014;32(6):811-8.

3Bedford TG,Tipton CM,Wilson NC,etal.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures〔J〕.J Appl Physiol Respir Envpir Exerc Physiol,1979;47(6):1278-83.

4陳蔚東，蔣青，陳東陽，等.P38阻斷劑對鼠關節炎軟骨細胞金屬蛋白酶表達的作用〔J〕.中國醫學科學院學報,2007;29(6)：777-81.

5Chen WP,Xiong Y,Shi YX,etal.Astaxanthin reduces matrix metalloproteinase expression in human chondrocytes〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;19(1):174-7.

6Zhang D,Huang B,Xiong C,etal.Pinocembrin inhibits matrixmetalloproteinase expression in chondrocytes 〔J〕.IVBMB Life,2015;67(1):36-41.

7Kobayashi M,Squires GR,Mousa A,etal.Role of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage〔J〕.Arthritis Rheum,2005;52(1):128-35.

8Suganuma K,Nakajima H,Ohtsuki M,etal.Astaxanthin attenuates the UVA-induced up-regulation of matrix-metalloproteinase-1 and skin fibroblast elastase in human dermal fibroblasts〔J〕.J Dermatol Sci,2010;58(2):136-42.

9Tao R,Wang S,Xia X,etal.Pyrroloquinoline quinone slows down the progression of osteoarthritis by inhibiting nitric oxide production and metalloproteinase synthesis〔J〕.Inflammation,2015;38(4):1546-55.

10Pelttari K,Lorenz H,Boeuf S,etal.Secretion of matrix metalloproteinase-3 by expanded articular chondrocytes as a predictor of ectopic cartilage formation capacity in vivo〔J〕.Arthritis Rheumatism,2008;58(2):467-74.

〔2015-12-31修回〕

(編輯袁左鳴)

陜西省體育局常規課題基金資助項目(No.13044)

劉紹東(1960-)，男，副教授，主要從事體育教育和健身指導研究。

R68

A

1005-9202(2016)18-4415-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.005