透明質酸對骨關節炎細胞模型中細胞蛋白多糖分泌功能的影響

趙　峰　何　薇　張國平　劉少俊　王　輝　石　碩

(河北醫科大學第一醫院骨科，河北　石家莊　050031)

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透明質酸對骨關節炎細胞模型中細胞蛋白多糖分泌功能的影響

趙峰何薇1張國平劉少俊王輝石碩

(河北醫科大學第一醫院骨科，河北石家莊050031)

目的探討透明質酸(HA)對體外培養的大鼠骨關節炎(OA)細胞增殖率及蛋白多糖分泌功能的影響。方法選取無特定病原體(SPF)級成年雄性SD大鼠1只，機械分離膝關節軟骨，經胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶消化，CO2恒溫培養，取第三代傳代細胞，將其與DMEM培養液混合制成的細胞懸液移入細胞培養板中，分為三組，每組8個孔，接受不同的處理方法。模型組以白細胞介素(IL)-1β建立體外OA細胞模型；HA組造模外加入不同濃度(10、50、100、150 μg/L)的透明質酸(HA)；對照組不加IL-1β和HA，均孵育72 h。分別采用四氮甲基唑藍(MTT)法及二甲基亞藍(DMB)比色法檢測各組軟骨細胞的增殖率及蛋白多糖的含量。結果模型組與HA組的細胞增殖率均顯著低于對照組(P<0.05)，而模型組與HA組比較無統計學差異(P>0.05)；模型組與HA組(10、50 μg/L)的蛋白多糖含量均顯著低于對照組，而HA 100、150 μg/L組的含量高于模型組(P<0.05)，而兩組與對照組相比均無統計學差異(P>0.05)。結論外源性HA可促進OA細胞對蛋白多糖的分泌功能，但對細胞增殖率無影響。

骨關節炎；透明質酸；蛋白多糖

骨關節炎(OA)病理基礎是關節軟骨中細胞減少和組織結構破壞〔1，2〕，研究表明，軟骨中蛋白多糖(PG)減少是造成軟骨組織結構破壞的重要原因〔3〕。透明質酸(HA)是一種酸性黏多糖，是關節滑液和軟骨基質中的重要組分，在潤滑關節、調節蛋白質和水電解質的擴散及運轉、調節血管壁通透性、促進創傷愈合、抑制炎癥反應等方面發揮重要作用；同時，HA也是PG組成的重要物質基礎，對保證軟骨組織形態結構的正常不可或缺。雖然美國骨科醫師學會(AAOS)在最新的骨關節炎治療指南中不推薦使用關節腔注射HA治療OA，但近年來有觀察發現，HA對改善OA患者的臨床癥狀作用顯著〔4〕，但其作用機制尚未完全闡明。本研究通過分析HA對PG分泌功能的影響，為探索OA的臨床治療方案及其作用機制提供新的線索。

1　材料與方法

1.1動物選取無特定病原體(SPF)級成年雄性SD大鼠1只，體質量120 g，由河北醫科大學動物實驗中心提供，合格證編號：DK0709-0165。于動物實驗室自由飲食喂養，室溫(25.0±2.0)℃，自然光照。

1.2方法

1.2.1大鼠軟骨細胞的分離與培養將大鼠麻醉、處死，摘取膝關節軟骨，手術過程注意無菌操作。將軟骨剪成1 mm3左右的小碎塊后，分別以胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶對軟骨碎片消化1 h，得到軟骨細胞懸液。將軟骨細胞接種于DMEM培養液中(含10%胎牛血清)，37℃ 5% CO2培養箱中培養，細胞貼壁后約2～3 d換液。待細胞匯集成片后棄去原培養基，以磷酸鹽緩沖液(PBS)(含1%青鏈霉素)漂洗2遍，后加入0.25%的胰蛋白酶(含0.01%EDTA)搖勻置于恒溫培養箱內消化3～5 min，傳代培養，取第三代細胞待用。

1.2.2OA細胞模型的建立與分組以DMEM培養液(含0.5%胎牛血清)將第三代軟骨細胞稀釋成細胞懸液，濃度為4×107/L。吸取100 μl置于96孔板上。分別取8個孔用于空白對照組(對照組)及OA細胞模型組(模型組)，另取32孔作為HA干預組(HA組)。其中，模型組及HA組均進行OA細胞模型建立：取1 μl白細胞介素(IL)-1β溶液(美國Sigma公司)加入各孔中(終濃度10 μg/L)，混勻，37℃ 5% CO2培養箱中孵育72 h，棄上清。造模成功判定標準為顯微鏡下軟骨細胞呈現胞質回縮，且胞內可見空泡。本次研究中40個孔均造模成功，成功率為100%。

1.2.3處理方法HA組在孵育前于各孔中加入100 μl不同濃度的HA(分子量為2×106U，美國Sigma公司)，使HA的終濃度分別為10、50、100、150 μg/L，各濃度HA組均為8個孔；對照組不加IL-1β和HA，模型組不加HA，于培養箱內孵育72 h。

1.3觀察指標

1.3.1四氮甲基唑藍(MTT)法檢測軟骨細胞的增殖率于各孔依次加入20 μl 5 g/L的MTT試劑(美國Sigma公司)及100 μl培養液(不含血清)，置于恒溫培養箱中再孵育4 h，棄上清，后加入甲瓚溶液200 μl。以酶標儀測定各溶液光密度值(OD)，設置主波長為570 nm，參比波長為690 nm。增殖率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.2二甲基亞藍(DMB)比色法檢測軟骨細胞中PG的含量取稀釋的細胞懸液(濃度為1×108/L)接種于24孔板上，每孔加入1 ml DMEM液(含10%胎牛血清)后，恒溫培養24 h。各組實驗方法中除所加IL-1β及HA溶液均為10 μl外，其他處理方法同上。孵育72 h后分離上清。于每孔加入1 ml細胞懸液裂解細胞，反應完全后移入5 ml試管內。加入1 ml 32 mg/L DMB溶液(美國Sigma公司)，充分混勻5 min后，以分光光度計比色(波長為525 nm)讀取吸光度值。

由于硫酸軟骨素是軟骨中PG的主要組成成分，且其含量與DMB比色法讀取的吸光度值呈良好的線性關系，因此，本研究以硫酸軟骨素含量的吸光度值做標準曲線，繪制的標準曲線方程為Y=0.028X-0.147，R Sq Linear=99.9%，可作為PG的標準曲線。操作：取濃度為5、10、15、20、25、30 mg/L的硫酸軟骨素標準液各1 ml，均加入DMB顯色劑1 ml，混勻，5 min后讀取各濃度液體于525 nm波長處的吸光度值，即得標準曲線。將所測軟骨細胞溶液的吸光度值代入標準曲線方程計算得PG的含量。

1.4統計學方法應用SPSS14.0軟件，正態分布、方差齊性資料進行單因素方差分析及兩兩比較的SNK-q檢驗。

2　結　果

模型組與HA組的細胞增殖率均顯著低于對照組(P<0.05)，而模型組與HA組比較均無差異(P>0.05)。模型組與HA組(10、50 μg/L)的PG含量均顯著低于對照組，而HA組(100、150 μg/L)組均顯著高于模型組(P<0.05)，而與對照組相比均無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1　HA對大鼠OA細胞增殖率和PG含量的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3　討　論

OA是骨科常見的慢性疾病，以軟骨的變性、破壞和骨質增生為主要特征，好發于中老年人群。目前OA的發病機制尚不明確，而細胞因子〔IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕是研究OA發病機制的重要因素，有研究認為，IL-1是OA產生的始動因子〔5〕，在促進軟骨細胞凋亡、降解細胞外基質等骨代謝過程中發揮重要作用。本研究顯微鏡下觀察顯示，IL-1β可造成軟骨細胞的形態變化，誘導OA細胞的產生。HA是一種由滑膜B細胞分泌的高分子黏多糖，在關節滑液和軟骨基質的組成中必不可少，對于維持細胞及基質的穩定和平衡、潤滑關節、營養和保護軟骨、抑制炎癥等具有重要作用〔6〕。有研究表明，關節液中HA含量的減低與OA的形成密切相關，可作為反映OA嚴重程度的重要指標〔7〕。此外，有研究發現，對OA患者注射外源性HA可顯著緩解臨床癥狀〔8〕，具有良好的治療效果。其作用機制主要有：①對關節軟骨應力進行覆蓋、潤滑和緩沖作用；②降低關節內炎癥反應；③正反饋促進內源性HA的分泌〔9〕。此外，HA在細胞增殖、合成和分化等方面也具有促進作用〔10〕，而本研究未發現其在退變軟骨細胞中的促增殖作用，這可能與本實驗僅為體外實驗，未形成體內軟骨組織相似的細胞外環境有關。另外，HA是關節內PG的主干成分，PG鏈上的大量糖胺多糖支鏈(GAG)可外伸與陽離子和水分子結合，使關節及組織具有巨大的抗壓力作用。同時，PG也是軟骨基質的主要成分。因此，關節內PG含量的穩定對于維持軟骨組織的結構和功能具有重要的支撐作用〔11〕。本研究結果顯示，高濃度的外源性HA可增加退變軟骨細胞中PG的含量，提示外源性HA可促進OA細胞中PG的合成和分泌。而研究未發現低濃度HA(10、50 μg/L)對PG的促分泌作用，提示低濃度HA對于PG的合成作用不顯著。原因可能是低濃度HA合成的PG含量較低，還不足以對其合成作用形成正反饋。

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2孟祥苗.葛根素對經IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原表達的影響〔D〕.福州：福建中醫藥大學，2014.

3Suutre S，Kerna I，Lintrop M，etal.Evaluation of correlation of articular cartilage staining for DDR2 and proteoglycans with histological tissue damage and the results of radiographic assessment in patients with early stages of knee osteoarthritis〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(5)：5658-65.

4Altman RD，Manjoo A，Fierlinger A，etal.The mechanism of action for hyaluronic acid treatment in the osteoarthritic knee：a systematic review〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2015；16(1)：321.

5霍雷.透明質酸鈉注射配合自體富血小板血漿注射治療膝骨關節炎的臨床及實驗研究〔D〕.蘇州：蘇州大學，2014.

6魏明波，吳燕麗.氨基葡萄糖聯合透明質酸鈉治療顳下頜關節骨關節病的臨床觀察〔J〕.口腔醫學研究，2013；29(6)：563-4，568.

7Sasaki E，Tsuda E，Yamamoto Y，etal.Serum hyaluronic acid concentration predicts the progression of joint space narrowing in normal knees and established knee osteoarthritis-a five-year prospective cohort study〔J〕.Arthritis Res Ther，2015；17(3)：283.

8Migliore A，Procopio S.Effectiveness and utility of hyaluronic acid in osteoarthritis〔J〕.Clin Cases Miner Bone Metab，2015；12(1)：31-3.

9劉契，鄧廉夫.骨關節炎相關細胞因子及蛋白的研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2013；13(1)：187-90.

10Wang Z，Wu G，Feng Z，etal.Microarc-oxidized titanium surfaces functionalized with microRNA-21-loaded chitosan/hyaluronic acid nanoparticles promote the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells〔J〕.Int J Nanomedicine，2015；10：6675-87.

11拉希德，劉世清.透明質酸對體外培養大鼠退變關節軟骨細胞的影響〔J〕.武漢大學學報(醫學版)，2007；28(2)：177-80，184.

〔2015-12-13修回〕

(編輯袁左鳴)

河北省2015年度醫學科學研究重點課題(No.20150640)

趙峰(1978-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事關節損傷與修復方面的研究。

R68

A

1005-9202(2016)18-4417-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.006

1河北醫科大學第三醫院手外科