全身垂直振動對去卵巢骨質疏松大鼠脛骨和子宮血管內皮生長因子蛋白表達的影響

司會群　卜淑敏　趙俊勇　文思敏　段曉麗

(首都體育學院，北京　100191)

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全身垂直振動對去卵巢骨質疏松大鼠脛骨和子宮血管內皮生長因子蛋白表達的影響

司會群1卜淑敏趙俊勇1文思敏段曉麗

(首都體育學院，北京100191)

目的探討全身垂直振動對去卵巢骨質疏松大鼠脛骨和子宮血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達的影響。方法采用去除大鼠雙側卵巢建立絕經后骨質疏松大鼠模型。將36只3個月齡雌性健康未孕SD大鼠按體重分層后隨機分為假手術組、去卵巢靜止組和去卵巢振動組。去卵巢10 w后，對去卵巢振動組進行為期7 w的全身垂直振動訓練。振動結束后，用ELISA檢測血清VEGF水平，用Western印跡檢測脛骨和子宮VEGF蛋白表達的變化。結果各組大鼠血清VEGF水平無顯著性差異。去卵巢靜止組大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白表達水平顯著低于假手術組(P<0.05)，而去卵巢振動組大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白表達水平顯著高于去卵巢靜止組(P<0.05;P<0.01)。結論全身垂直振動訓練能上調去卵巢骨質疏松大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白的表達。

去卵巢大鼠；全身垂直振動；血管內皮生長因子

藥物治療雖然在一定程度上能緩解絕經后骨質疏松(PMOP)的癥狀，但也會給身體其他系統帶來不良反應，甚至還會出現不可耐受的副作用或并發癥，如藥物過敏、不正常的或大量的子宮出血、子宮內膜增生、乳房脹痛、乳腺腫瘤等，給患者帶來極大的痛苦和不便〔1，2〕。運動訓練是預防和減緩PMOP的另一方法，并且具有明顯的優勢。但運動方式的選擇很關鍵，有些運動對治療PMOP雖好，但易增加患者患骨關節炎、骨骼變形、骨折的危險〔3〕。實驗研究發現，全身垂直振動訓練可能是一種更自然、更便捷，更安全有效的治療骨質疏松的方式〔4,5〕，但其機制還不完全清楚。本研究觀察全身垂直振動訓練對去卵巢骨質疏松大鼠血清以及子宮和脛骨近端血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與飼養3個月齡健康雌性未孕SD大鼠36只，體重(221g±12)g，由北京維通利華實驗動物中心提供并飼養，〔動物合格證號SCXK(京)2011-0039〕。每籠飼養4～5只大鼠，標準嚙齒類動物飼料喂養，自由飲水和進食，飼養室溫度：22℃～25℃，相對濕度：50%～55%，人工控制12 h光照(7：00～19：00)，12 h黑暗(19：00～次日7：00)交替進行。整個實驗過程中，按照實驗動物使用的3R(減少、替代、優化)原則給予大鼠人道的關懷。

1.2手術方法與分組適應性喂養大鼠1 w后，稱量初始體重，按體重先分層后，再隨機分為假手術組12只和去卵巢組24只。兩組大鼠均于手術前禁食12～18 h。去卵巢手術在北大醫學部動物實驗科學部進行，假手術組大鼠保留卵巢，只切除卵巢邊與卵巢等大的脂肪組織。大鼠手術后可以飲水，但24 h后方可進食。各組大鼠術后靜養10 w，以造去卵巢骨質疏松模型，10 w末，用雙能X線骨密度儀檢測大鼠脛骨近端在體骨密度，如去卵巢大鼠骨密度值顯著低于假手術組就說明造模成功。將去卵巢組大鼠按體重分層，再隨機分為去卵巢靜止組(12只)和去卵巢振動組(12只)。實驗過程中去卵巢靜止組有2只大鼠相繼死亡，實驗最后各組剩余大鼠數目分別為假手術組12只，去卵巢靜止組10只，去卵巢振動組12只。

1.3振動方案去卵巢后第11周，去卵巢振動組大鼠先進行1 w的適應性振動訓練，每天2次，每次10 min，頻率50 Hz，振動加速度3.8 g，振幅0.9 mm。從第12周開始，進行為期7 w的正式振動訓練，每天2次，每次15 min，間隔15 min，頻率90 Hz，振動加速度3.8 g，振幅0.5 mm，正式振動7 w，所有振動實驗均在上午進行。

1.4樣品的收集末次振動結束后24～36 h內處死全部大鼠。術前均禁食12 h，稱量體重。先腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，后腹主動脈取血處死，血放置4℃冰箱過夜，4℃、3 000 r/min、離心20 min，取上層血清分裝，標注后置于-80℃冰箱用于血清VEGF檢測。取血后迅速游離子宮、按解剖位置準確游離左、右后肢脛骨，將周圍附著的軟組織和肌肉剔除干凈，將子宮和右后肢脛骨近端置于液氮中凍存待測。

1.5血清VEGF水平檢測從室溫放置30 min后的鋁箔密封袋中取出實驗所需板條，標準品孔中各加50 μl不同濃度的標準品。待測樣品孔中先加10 μl待測樣品，再加40 μl樣品稀釋液。隨后標準品孔和待測樣品孔中每孔均加入50 μl辣根過氧化酶標記的檢測抗體，用封板膜封住反應孔，37℃恒溫箱溫育60 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液后靜止1 min后再甩去，再在吸水紙上拍干，如此反復洗板5次，每孔加50 μl底物A、B，37℃避光孵育15 min，每孔再加50 μl終止液，即刻(3 min內)在450 nm波長處測定各孔OD值，保留讀數結果并進行統計處理。

1.6Western印跡檢測子宮和脛骨VEGF蛋白表達的變化取出各組大鼠子宮和脛骨蛋白提取樣本，室溫融化后迅速上樣，在4℃冰箱中電泳2 h，起始電壓80 V，大約40 min后電壓調到120 V，電泳結束后，4℃冰箱中以電壓80 V轉膜2 h，浸入用TBS緩沖液稀釋成5%的脫脂牛奶中，室溫水平搖床封閉1 h，加1∶400稀釋的一抗，4℃冰箱孵育過夜，次日，置水平搖床上室溫繼續孵育1 h，TBS溶液洗膜4次，10 min/次，加入TBS溶液稀釋的馬抗鼠IgG/堿磷酶標記，室溫孵育2 h，TBS溶液洗膜4次，10 min/次；BCIP/NBT顯色，蒸餾水終止顯色，利用Quantity One軟件對各蛋白條帶照片進行掃描，記錄灰度值與β-actin灰度值之比，作為該蛋白表達的相對值。

1.7統計學方法采用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析，LSD post-hoc檢驗或Tamhane post-hoc檢驗。

2　結　果

2.1體重的變化振動結束后，與假手術組比較，去卵巢靜止組大鼠體重顯著增加；與去卵巢靜止組比較，去卵巢振動組大鼠體重雖沒有顯著變化，但振動前后體重增加量顯著低于去卵巢靜止組。結果提示，全身垂直振動訓練能顯著抑制去卵巢骨質疏松大鼠體重的增長。見表1。

表1　各組大鼠體重的變化±s,g)

與假手術組比較：1)P<0.01；與本組振動前比較：2)P<0.05；與去卵巢靜止組比較：3)P<0.01

2.2子宮VEGF蛋白表達的變化Western印跡結果顯示，去卵巢靜止組大鼠子宮VEGF蛋白表達水平(0.828 7±0.003 6)顯著低于假手術組(0.875 4±0.001 2)，而去卵巢振動組大鼠VEGF蛋白表達水平(0.879 9±0.004 1)顯著高于去卵巢靜止組，結果提示，全身垂直振動訓練能促進去卵巢骨質疏松大鼠子宮VEGF蛋白的表達。見圖1。

圖1　子宮VEGF蛋白的表達水平

2.3脛骨VEGF蛋白表達的變化Western印跡結果顯示，去卵巢靜止組大鼠VEGF蛋白表達水平(1.978 5±0.053 6)顯著低于假手術組(3.459 6±0.045 7)，而去卵巢振動組大鼠VEGF蛋白表達水平(3.758 5±0.045 1)顯著高于去卵巢靜止組。結果提示，全身垂直振動訓練能促進去卵巢骨質疏松大鼠脛骨VEGF蛋白的表達。見圖2。

圖2　脛骨VEGF蛋白的表達水平

2.4血清VEGF水平的變化假手術組VEGF為(160.645 8±18.443 9)pg/ml,去卵巢靜止組為(174.499 6±33.899 4)pg/ml,去卵巢振動組為(161.980 1±23.238 5)mg/ml。3組大鼠血清VEGF水平沒有顯著性差異，提示全身垂直振動訓練對去卵巢骨質疏松大鼠血清VEGF水平無顯著影響。

3　討　論

本實驗各組大鼠手術后造模10 w過程中，因自然生長，各組大鼠體重均增加，去卵巢組增加迅速，去卵巢手術10 w時即振動前，體重稱量結果顯示，與假手術組相比較，去卵巢造成體重顯著增加。與去卵巢后體重變化的相關報道〔6〕及我們實驗室前期實驗結果相吻合，初步表明了去卵巢手術的成功。本文結果表明，全身垂直振動訓練能顯著緩解由于去除卵巢引起的大鼠體重的增加。此結果與Maddalozzo等〔7〕報道得研究結果類似。此外，本次實驗中，去卵巢振動組振動訓練后體重依然超過正常大鼠體重，出現此結果的可能原因之一，是全身垂直振動對體重的抑制作用還不能完全抵消去卵巢對大鼠體重的影響，振動后體重依然會升高，只是增長的速度減緩。

VEGF是強有力的血管生成因子，它特異性受體相結合后，產生強大促進血管內皮細胞增殖的作用，引起血管加速生長。本實驗結果提示，全身垂直振動訓練能有效扭轉大鼠因去除卵巢引起的子宮VEGF蛋白表達降低的狀況，VEGF強大促血管生成功能使大鼠子宮血管生長加速，促進血流和營養物質的運輸和吸收，有利于骨質疏松大鼠子宮功能的改善。

VEGF也是骨生長因子，與骨代謝密切相關，協調著骨細胞分化、骨形成和骨吸收過程〔8,9〕，同時還在維持成骨細胞壽命中起著作用〔10〕。已有實驗表明，血管生成在骨量轉換發生的耦聯中起到了關鍵作用〔11〕，一方面VEGF作為機體內最強的血管生長因子，通過血管化來參與骨的發育和形成，另一方面，VEGF也直接參與成骨和破骨的作用〔12〕，被看作骨代謝因子。多種生長因子可促進VEGF的分泌，VEGF可能是某些骨生長因子發揮作用的中介。VEGF也能直接作用于成骨細胞，促進成骨細胞的增殖和分化，使局部成骨細胞數量增加，加速骨的形成，而成骨細胞也能夠產生旁分泌因子來影響血管內皮細胞的功能。本實驗結果發現，去卵巢導致VEGF蛋白表達降低。此結果與Kodama等〔13〕實驗結果相同。本實驗結果與李磊〔14〕報道得結果相似，說明機械振動不僅能增加去卵巢骨質疏松大鼠脛骨VEGF蛋白的表達，而且能促進去卵巢骨折大鼠VEGF蛋白的表達。可見VEGF可能是振動促進骨形成的一種有效刺激信號。全身垂直振動訓練能上調去卵巢骨質疏松大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白的表達水平。

1Sipos W,Pietschmann P,Rauner M,etal.Pathophysiology of osteoporosis〔J〕.Wien Med Wochenschr,2009;159(9-10):230-4.

2Rossouw JE,Prentice RL,Manson JE,etal.Postmenopausal hormone therapy and risk of cardiovascular disease by age and years since menopause〔J〕.JAMA,2007;297(13):1465-77.

3范剛.影響骨質疏松癥治療效果的運動因素〔J〕.太原職業技術學院學報,2008;89(12):157-8.

4Pigozzi F,Rizzo M,Giombini A,etal.Bone mineral density and sport:effect of physical activity 〔J〕.Sports Med Phys Fitness,2009;49(2):177-83.

5Chmitt NM,Schmitt J,Doren M.The role of physical activity in the prevention of osteoporosis in postmenopausal women-An update 〔J〕.Maturitas,2009;63(1):34-8.

6Stunes AK,Syversen U.Skeletal effects of the saturated 3-Thia fatty acid tetradecylthioacetic acid in rats 〔J〕.PPAR Res,2011;2011(1):241-62.

7Maddalozzo GF,Iwaniec UT,Turner RT,etal.Whole-body vibration slows the acquisition of fat in mature female rats 〔J〕.Int J Obes(Lond),2008;32(9):1348-54.

8Patrick Ross F,Angela MC.Nothing but skin and bone 〔J〕.Clin Invest,2006;15:116.

9Zhang Q,Guo R.VEGF-C a lymphatic growth factor is a RANKL target an autocrine mechanism〔J〕.J Biol Chem,2008;283(19):13491-9.

10Street J,Lenehan B.Vascular endothelial growth factor regulates osteoblast survival-evidence for an autocrine feedback mechanism 〔J〕.J Orthop Surg Res,2009;4(1):19.

11Zelzer E,McLean W,Ng YS,etal.Skeletal defects in VEGF(120/120)mice reveal multiple roles for VEGF in skeletogenesis 〔J〕.Development,2002;129(8):1893-904.

12Roy H,Bharlwaj S，Yla-herttuala S,etal.Biology of vascular endothelial growth factors 〔J〕.FEBS Lett,2006;580(12):2879-87.

13Kodama I,Niida S,Sanada M,etal.Estrogen regulates the production of VEGF for osteoclast formation and activity in op/op mice 〔J〕.J Bone Mineral Res,2004;2(19):200.

14李磊.機械振動協同骨髓干細胞動員對大鼠閉合性骨折愈合血管生成的影響及其可能機制〔D〕.西安：陜西師范大學,2012:6.

〔2015-02-09修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

北京市市屬高等院校長城學者項目資助(CIT&TCD20130337)

卜淑敏(1967-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事運動醫學研究。

司會群(1974-)，女，碩士，中學一級教師，主要從事運動醫學研究。

R338

A

1005-9202(2016)18-4423-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.009

1冀州市職業技術教育中心