高膽固醇飲食聯合球囊損傷建立兔腹主動脈粥樣硬化模型及評價

曹桂秋　李玲玲　劉立志　王貴鵬　徐　潔　駱小梅

(新疆醫科大學第五附屬醫院體檢科，新疆 　烏魯木齊　830011)

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高膽固醇飲食聯合球囊損傷建立兔腹主動脈粥樣硬化模型及評價

曹桂秋李玲玲1劉立志2王貴鵬2徐潔2駱小梅2

(新疆醫科大學第五附屬醫院體檢科，新疆 烏魯木齊830011)

目的探討高膽固醇飲食聯合球囊損傷建立兔腹主動脈粥樣硬化模型及評價方式。方法選擇雄性新西蘭大耳白兔16只，隨機分為對照組(n=8)和實驗組(n=8)，適應性喂養1 w后，兩組均通過手術造成腹主動脈球囊損傷，對照組給予普通飲食(基礎飼料)，實驗組給予高膽固醇飲食，兩組均喂養12 w。分析飼養前后血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平。飼養12 w后，采用血管造影和超聲計算藥物刺激后收縮率；處死試驗模型，并對硬化血管進行病理學檢查。結果飼養后，對照組血脂指標與飼養前比較無顯著差異(均P>0.05)，實驗組飼養后TC、TG、LDL水平較飼養前顯著升高，且均高于對照組(均P<0.05)。實驗組藥物刺激后收縮率均顯著高于同組正常部位與對照組損傷部位(均P<0.05)；實驗組硬化分級、內膜厚度和內膜增生面積均顯著高于對照組，管腔面積顯著低于對照組(均P<0.05)。結論膽固醇飲食聯合球囊損傷建立兔腹主動脈粥樣硬化模型效果良好、穩定，血液生化指標和組織病理改變典型，并可用血管造影和超聲的方法確定斑塊性質，可靠實用，是研究動脈粥樣硬化的良好模型。

膽固醇；球囊損傷；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的重要病因，粥樣硬化斑塊會增加動脈管腔狹窄程度，導致組織供血不足，引發心腦血管事件的發生，更嚴重的是粥樣斑塊破裂導致的急性血栓栓塞〔1〕。研究表明，斑塊破裂導致的血栓形成是導致血管事件的根本原因，其中狀態不穩定、具有高危破裂傾向的斑塊稱之為“易損斑塊”〔2〕。研究“易損斑塊”必須建立在具有特征性的動物模型上。兔是食草性動物，不易自發形成AS，但其對高脂飲食敏感，是常見的建模動物〔3〕。國內外已有許多研究選擇兔作為構建AS的模型，但是各研究在模型的構建方法、病變的描述和評價上存在差異，導致研究間難以交流和比較，研究結果也缺乏良好的兼容性〔4〕。本研究結合已有研究方法，提出高膽固醇飲食聯合球囊損傷建立兔腹主動脈AS模型，并從血脂、血管超聲和組織病理三個方面評價該模型。

1　材料與方法

1.1動物與方法選擇雄性新西蘭大耳白兔(清潔級)16只，4月齡，體質量2.2～2.5 kg，由我院動物實驗中心提供，所有動物單籠飼養，自由飲水，保持12 h晝夜節律，恒定溫度和濕度。隨機將動物分為對照組和實驗組，各8只。適應性喂養1 w后，兩組均通過手術造成腹主動脈球囊損傷，對照組給予普通飲食(基礎飼料)，實驗組給予高膽固醇飲食，高膽固醇飼料組成：4%膽固醇+10%豬油+86%基礎飼料。兩組均喂養12 w。

1.2儀器和試劑膽固醇購自Sigma公司，速眠新(2 ml/支，120627，吉林華牧動物保健)，鹽酸戊巴比妥那注射液(5 ml：0.1 g/支，121203，上海朝暉藥業)，馬來酸麥角新堿(1.5 ml/支，130307，揚子江楊業)，普通球囊導管和附件(球囊3.0～3.5 mm×15 mm，Coridis公司)，球囊擴張壓力泵(Coridis公司)，4 F橈動脈鞘管和21 G橈動脈穿刺針(Coridis公司)，ATW PTCA引導鋼絲(0.014 mm×195 cm，Coridis公司)；全自動生化分析儀(日立7600，日本)，超聲診斷儀(GM LOGIQ 400 PRO，美國)，組織脫水機、石蠟包埋系統、切片機(ASP300S、EG1150、RM2235，LEICA，德國)。

1.3球囊損傷術動物術前禁食12 h，3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈聯合速眠新0.05 ml/kg肌注麻醉，動物麻醉成功后表現為呼吸深慢、四肢癱軟、角膜反射遲緩，此時通過耳緣靜脈注射肝素鈉200 IU/kg，并將兔固定兔臺。剪去兔右側后腿內側毛發，常規皮膚消毒，在股動脈搏動明顯處切口，沿動脈走行方向逐層切開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，顯露股動脈并分離約3～4 cm，結扎遠心端。用21 G橈動脈穿刺針進行股動脈穿刺術，借助導絲插入4 F橈動脈鞘管，抽血4 ml進行血生化檢驗，分析總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。在經皮冠狀動脈腔內成型術導絲引導下，逆行送入球囊導管，使球囊位于腹主動脈，選擇L3-L4腰椎水平的腹主動脈作為內皮損傷靶點，維持壓力0.61～1.01 MPa充盈球囊，并來回拉動增加血管內皮損傷程度，若拉動阻力較小提示球囊直徑不夠，則替換更大直徑球囊，重復操作3次，損傷腹主動脈內膜。推出球囊和導絲，拔出鞘管，壓迫止血5 min，并包扎血管，逐層縫合關閉切口，術后連續3 d肌注青霉素80萬U/d。

1.4影像學檢查喂養12 w后，麻醉后切開上述相同位置皮膚，采用橈動脈穿刺針對右股動脈進行穿刺，導入鞘管，取血4 ml檢測血脂指標，在X射線下經鞘管注射4 ml造影劑，在注射前后行正后前位造影，測定球囊損傷部位血管和鄰近部位血管直徑。動脈內給予麥角新堿，3 min后再次造影，測定藥物刺激后血管直徑，并計算收縮率=(刺激前血管直徑-刺激后血管直徑)/刺激前血管直徑。

1.5病理檢查檢測完收縮率后，過量麻醉處死，解剖動物，截取腹主動脈約2 cm，生理鹽水沖洗干凈后保存于4%多聚甲醛中，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察。依據美國心臟病協會血管病變委員會推薦的《AS分級標準》〔5〕對實驗動物組織切片進行觀察分級：0級，內膜光滑，無奶油樣病變；1級，內膜有奶油樣病變，但未見突出表面的斑塊；2級，有斑塊突出，面積<3 mm2；3級，有散在斑塊，面積>3 mm2；4級，斑塊融合成片，且面積>3 mm2；5級，斑塊幾乎覆蓋整個動脈內膜。通過圖像分析軟件計算管腔面積、內膜厚度、增生內膜面積。

1.6統計學方法應用SPSS17.0軟件，計量資料組間比較采用t檢驗，計數資料組間比較用χ2檢驗。

2　結　果

2.1兩組動物飼養前后血脂水平比較飼養前，兩組動物血脂各指標均無顯著性差異(均P>0.05)；12 w后，對照組血脂指標仍未見顯著差異(均P>0.05)，實驗組TC、TG、LDL水平較飼養前顯著升高，且均高于對照組(均P<0.05)，HDL在飼養前后略有升高，但未見統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2兩組動物藥物刺激后血管收縮率比較主動脈造影后，給予藥物刺激，結果顯示，實驗組球囊損傷部位收縮率為(0.48±0.18)%，與同組正常部位〔(0.08±0.02)%〕比較有統計學差異(P<0.05)，與對照組損傷部位〔(0.08±0.03)%〕比較也有統計學差異(P<0.05)。對照組鄰近正常部位血管收縮率為(0.07±0.02)%。

2.3兩組動物病理檢查結果比較直視下可見對照組血管柔軟有彈性，顏色均勻呈粉色，管腔內光滑；實驗組血管僵硬，黃白相間，內壁增厚凸起。HE染色后可見對照組內皮細胞完整，中層肌細胞排列整齊，形態正常，胞質呈酸性紅染，可見少量脂質沉積；實驗組內皮脫落，可見粥樣斑塊，在斑塊中可見新生血管和炎細胞浸潤，內膜下可見泡沫細胞，平滑肌排列紊亂并增生，胞質嗜酸性減少。實驗組硬化分級、管腔面積、內膜厚度和內膜增生面積與對照組有顯著差異(P<0.05)。見表2。

表1　兩組動物飼養前后血脂水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與飼養前比較：2)P<0.05

表2　兩組動物病理檢查結果比較±s,n=8)

3　討　論

實驗動物模型是研究相應疾病的基礎，目前較常用的造模動物為小鼠和兔，但是小鼠血漿膽固醇水平較低，且存在于HDL顆粒中，很難誘導AS；載脂蛋白缺陷和(或)LDL受體缺乏的小鼠雖然易形成AS，但是價格高昂〔6〕。其他動物如猴、豬、狗，同樣受限于費用和體型，不宜大樣本造模和研究〔7〕。理想的動物模型應當具備如下特征：①具有與人類相似的疾病特征和發生發展過程；②動物與人類具有共同的致病因素；③造模方法簡單易行，成功率高；④模型穩定，疾病特征明顯，可重復性高；⑤造模成本低〔8〕。

研究表明，高脂飲食可引起兔血脂水平升高，會同時作用于兔全身血管，但是不同部位血管及不同節段的血管的病變并不是同步發生的，胸主動脈發展最快程度最深，其次為主動脈根部，再次是腹主動脈〔9〕。然而飲食造模的周期比較長，且進展緩慢。本研究在傳統飲食法的基礎上調整膽固醇攝入量為5%，同時聯合應用球囊損傷法，造成腹主動脈內膜的損傷，可增加造模成功率并縮短造模時間，避免長期高脂飲食導致的其他疾病對研究的干擾〔10〕。研究結果證實，高膽固醇飲食顯著造成了兔高膽固醇血癥，與以往研究一致〔11〕，LDL的長期高水平可損傷血管內皮，增加造模成功率。

動物AS模型的評價，目前主要依據病理檢查，但此法必須處死動物，不利于進一步研究斑塊的發生發展和藥物干預〔12〕。本研究結合血管造影和血管內超聲，不僅能觀察到斑塊，還可以檢測斑塊性質。結果顯示，實驗組球囊損傷部位血管收縮率顯著高于正常血管，提示該法評價斑塊易損性具有較高的判斷價值。此外，病理學檢查顯示結果與現階段所掌握的動脈粥樣硬化病變的特點一致〔13〕，提示該造模方法顯著有效。

綜上所述，膽固醇飲食聯合球囊損傷建立兔腹主動脈AS模型造模效果良好、穩定，血液生化指標和組織病理改變典型，并可用血管造影和超聲的方法確定斑塊性質，可靠實用，是研究AS的良好模型。

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12Zhang G,Chen Y,Bilal-Waqar A,etal.Quantitative analysis of rabbit coronary atherosclerosis.Practical techniques utilizing open-source software〔J〕.Anal Quant Cytopathol Histpathol,2015;37(2):115-22.

13Li C,Tu Y,Liu TR,etal.Rosiglitazone attenuates atherosclerosis and increases high-density lipoprotein function in atherosclerotic rabbits〔J〕.Int J Mol Med,2015;35(3):715-23.

〔2015-11-19修回〕

(編輯袁左鳴)

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(No.2014211C124)

曹桂秋(1972-)，女，博士，主任醫師，主要從事心血管疾病、老年疾病診療及營養保健方面的研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)18-4426-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.010

1新疆醫科大學第五附屬醫院超聲科

2新疆醫科大學第五附屬醫院心內科