11β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶1型、促酰化蛋白在肥胖大鼠伴高脂血癥形成中的機(jī)制

吳國(guó)瓊　林　梅　張　雨　郭菲菲　候亞莉　邱　璇　鄧春地　楊艷群　袁惠萍

(武漢市普愛(ài)醫(yī)院(西院)內(nèi)分泌科，湖北　武漢　430034)

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11β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶1型、促酰化蛋白在肥胖大鼠伴高脂血癥形成中的機(jī)制

吳國(guó)瓊林梅張雨郭菲菲候亞莉邱璇鄧春地楊艷群袁惠萍

(武漢市普愛(ài)醫(yī)院(西院)內(nèi)分泌科，湖北武漢430034)

目的11β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)、促酰化蛋白(ASP)在肥胖伴高脂血癥中的機(jī)制。方法隨機(jī)選取SD雄性大鼠60只，均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組施以高脂飲食，對(duì)照組常規(guī)飲食，觀(guān)察1～8 w進(jìn)食量、體重和血壓的變化；并在8 w后檢測(cè)甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平。處死動(dòng)物取其肝臟，利用RT-PCR方法測(cè)量組織中11β-HSD1、脂蛋白酯酶(LPL)mRNA的變化，利用轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞并與不同濃度ASP培養(yǎng)，以正常脂肪細(xì)胞作為對(duì)照，觀(guān)察細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活性。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組食量先下降后上升，而對(duì)照組逐漸下降；實(shí)驗(yàn)組體重急劇上升，且大于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組血壓逐漸上升，而對(duì)照組維持一定水平；在第8周，實(shí)驗(yàn)組血脂水平顯著高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組11β-HSD1 mRNA水平大于對(duì)照組，而LPL mRNA水平則相反；隨著ASP溶液濃度的升高，未轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞活力逐漸上升。而轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞活力不變，而細(xì)胞凋亡與此相反。結(jié)論11β-HSD1是導(dǎo)致高脂血癥和肥胖的一個(gè)有效因素，ASP通過(guò)11β-HSD1基因片段對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響脂類(lèi)代謝。

11β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶Ⅰ型；促酰化蛋白；肥胖；高脂血癥

肥胖癥是一種多因素導(dǎo)致的慢性代謝性疾病〔1〕，肥胖人群中高脂血癥的發(fā)病率達(dá)50%以上〔2〕，由此導(dǎo)致冠心病、高血壓、動(dòng)脈硬化性血管病、2型糖尿病的發(fā)生和病死率也顯著增高。肥胖癥的脂代謝異常發(fā)生機(jī)制有很多，11β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)、促酰化蛋白(ASP)參與高脂血癥的形成，但兩者在肥胖患者脂代謝中的關(guān)系尚不清楚。本文研究11β-HSD1及ASP在肥胖伴高脂血癥形成過(guò)程中的相互聯(lián)系。

1　材料與方法

1.1材料60只清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重150～200 g，常規(guī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組30只。人類(lèi)成骨細(xì)胞3T3-L1前脂肪細(xì)胞在1∶1混合Ham′s F12的基質(zhì)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中添加2.5 mmol/L左旋谷酰胺和 0.3 mg/ml G418 (Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)，并且添加10%小牛血清 hFOB 1.19 細(xì)胞在5% CO2，37℃溫箱中培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1造模并檢測(cè)靜脈血中脂蛋白酯酶(LPL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平對(duì)照組給予常規(guī)普通基礎(chǔ)飼料，食量不低于15 g，水量不低于30 ml；實(shí)驗(yàn)組除了基礎(chǔ)飼料外，還給予高脂高營(yíng)養(yǎng)飼料(100 g基礎(chǔ)飼料中加入全脂奶15 g 、豬油5 g、雞蛋黃50 g、黃豆15 g、魚(yú)肝油10滴)喂養(yǎng)6～8 w，通過(guò)檢測(cè)大鼠體重并參考2010年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟制訂的代謝綜合征全球共識(shí)要求，滿(mǎn)足TG、LDL，高血壓和空腹血糖(FPG)升高，確定是否造模成功。用ELISA法檢測(cè)血漿ASP(北京方程生物科技有限公司，北京)水平，自動(dòng)生化分析(iChem-340全自動(dòng)生化分析儀，庫(kù)倍兒，深圳)測(cè)定血漿TG、TC、LDL、VLDL、HDL水平。

1.2.2RT-PCR方法檢測(cè)各組織11β-HSD1和LPL mRNA水平造模成功后處死大鼠，并去全部大鼠的肝臟、脂肪和肌肉，液氮速凍后放入研缽，研碎，按照常規(guī)組織提取RNA的方法離心，并加入氯仿、異丙醇，反復(fù)離心，最后去白色凝膠樣沉淀，去除上清液后用DEPC-水溶液溶解，取10 μl，加入1 μl Oligo dT，水浴后再冰浴，全部參照試劑說(shuō)明書(shū)操作。1β-HSD1引物：上游：5′-GCAGAGCGATTTGTTGTT-3′，下游：5′-TGTCATATGAAGCCGAGGA-3′；LPL的上游引物5′-GGACGGTGACAGFAATGTATG-3′，下游引物5′-CAGCACGATCCAGACCACTAA-3′，各引物鏈均由上海生工合成。按照PCR的反應(yīng)條件和流程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，用免疫熒光法定量檢測(cè)mRNA濃度。

1.2.311β-HSD1 siRNA設(shè)計(jì)技術(shù)通過(guò)GenBank查詢(xún)得到11β-HSD1的cDNA序列，利用WIsiRNA Selection Program提供的設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)以11β-HSD1基因?yàn)榘袠?biāo)的siRNA，其中實(shí)驗(yàn)組選用兩個(gè)獨(dú)立的、針對(duì)該靶基因的siRNA，設(shè)計(jì)結(jié)果為6條64 nt的寡聚核苷酸單鏈，每?jī)蓷l互補(bǔ)，送生物技術(shù)公司合成。

1.2.4重組腺病毒11β-HSD1 siRNA載體構(gòu)建技術(shù)特異性針對(duì)11β-HSD1基因的寡聚核苷酸單鏈在Tris鹽/EDTA緩沖系統(tǒng)(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Nacl，pH8.0)中退火為雙鏈，在連接到BglⅡ/HindⅢ雙酶切線(xiàn)性化pSUPER載體上，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，再用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切含siRNA表達(dá)盒子的pSUPER載體，并將其連接到同樣雙酶切的穿梭載體EH006上，然后和腺病毒輔助質(zhì)粒Pjm17 共轉(zhuǎn)染HEK293進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒11β-HSD1 RNAi表達(dá)載體。PCR鑒定，并利用終末稀釋法測(cè)定腺病毒滴度。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將FuGENE HD轉(zhuǎn)染劑、重組質(zhì)粒和無(wú)菌水放置室溫下，在六孔板中配置轉(zhuǎn)染液，每孔中吸入100 μl無(wú)菌水、2 μg重組質(zhì)粒和6 μl FuGENE HD，混勻。室溫放置15 min，待六孔板中細(xì)胞80%～90%3T3-L1脂肪細(xì)胞融合時(shí)，加入上轉(zhuǎn)染液100 μl，慢速混勻30 s，培養(yǎng)72 h分析結(jié)果。

1.2.6Western印跡檢測(cè)11β-HSD1蛋白表達(dá)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3T3-L1脂肪細(xì)胞的11β-HSD1蛋白表達(dá)情況。

1.2.7MTT檢測(cè)細(xì)胞活性將3T3-L1脂肪細(xì)胞分別放在含有0、50、100和200 mg/L ASP溶液中培養(yǎng)24 h,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。加入20 μl終濃度為5 mg/ml的MTT，將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)4 h。之后小心移除上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，放置于搖床上震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，用移液器反復(fù)吹吸使晶體溶解。培養(yǎng)板放于37℃培養(yǎng)，溶解氣泡后，用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定，計(jì)算公式為實(shí)驗(yàn)孔A570/對(duì)照孔A570×100%。

1.2.8細(xì)胞凋亡檢測(cè)用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)分析細(xì)胞凋亡的百分率。將轉(zhuǎn)染3T3-L1的脂肪細(xì)胞放在含有0、50、100和200 mg/L ASP的溶液中培養(yǎng)24 h，處理后細(xì)胞在2 000 r/min離心5 min，然后用PBS洗滌2次，吸取250 μl的2×結(jié)合緩沖液和250 μl去離子水，混勻，然后將細(xì)胞懸浮于400 μl×結(jié)合緩沖液中，使?jié)舛葹?×105cells/ml，再加入5 μl Annexin V-FITC和碘化丙啶，上下顛倒混勻。處理過(guò)的細(xì)胞放于暗室進(jìn)行5～15 min放射處理，然后進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀參數(shù)(EX=488 nm，Em=530 nm)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1兩組大鼠進(jìn)食量及體重變化第1周，兩組大鼠進(jìn)食量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，1 w后實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)食量明顯下降，與對(duì)照比較差異顯著，實(shí)驗(yàn)組食量下降一直持續(xù)到第3周。實(shí)驗(yàn)組體重從第4周開(kāi)始逐漸較對(duì)照增大，一直持續(xù)到第8周，組間比較差異顯著。見(jiàn)表1，表2。

2.2兩組大鼠收縮壓比較實(shí)驗(yàn)組血壓與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表3。

2.3兩組FPG、TG、VLDL、HDL、TC、LDL水平比較實(shí)驗(yàn)組FPG、TG、VLDL、HDL、TC、LDL水平高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異。見(jiàn)表4。

2.411β-HSD1 mRNA和LPL mRNA水平比較實(shí)驗(yàn)組11β-HSD1 mRNA(1.19±0.14)高于對(duì)照組(0.85±0.32)；而LPL mRNA(1.2±0.22)低于對(duì)照組(1.7±0.42)(t=-3.25，P=0.00)。

2.5轉(zhuǎn)染后3T3-L1脂肪細(xì)胞的11β-HSD1蛋白表達(dá)情況轉(zhuǎn)染后3T3-L1脂肪細(xì)胞的11β-HSD1蛋白表達(dá)(0.34±0.04)遠(yuǎn)低于未轉(zhuǎn)染組(1.54±0.11，t=0.124，P=0.000)。

2.6轉(zhuǎn)染后3T3-L1脂肪細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞用不同濃度的ASP溶液培養(yǎng)細(xì)胞活力的測(cè)量隨著ASP溶液濃度的升高，未轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞活力逐漸上升。而轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞活力不變(分別為41%，43%，45%和42%)。

2.7轉(zhuǎn)染后3T3-L1脂肪細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞用不同濃度的ASP溶液培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的測(cè)量隨著ASP溶液濃度的升高，未轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞凋亡率逐漸下降。而轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞活力不變(分別為15%，14%，13%和14%)。

表1　大鼠不同組別進(jìn)食量隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

表2　不同組別大鼠體重隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化

表3　不同組別大鼠收縮壓隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化

表4　不同組別大鼠在第8周血脂和血糖水平比較

3　討　論

11β-HSD1是機(jī)體中重要的糖皮質(zhì)激素代謝酶，可使無(wú)活性的潑尼松轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘臍浠瘽娔崴桑瑥亩{(diào)節(jié)多種物質(zhì)代謝。由于糖皮質(zhì)激素(GC)過(guò)量所致的庫(kù)欣綜合征(CS)中表現(xiàn)的中心性肥胖和血脂異常與肥胖高脂血癥類(lèi)似。有研究報(bào)道，CS患者內(nèi)臟脂肪的分布與11β-HSD1活性增高有關(guān)〔3〕。也有研究將脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(Ap)2前體轉(zhuǎn)至正常小鼠，使11β-HSD1在脂肪組織中特異性地過(guò)度表達(dá)，可產(chǎn)生肥胖及高脂血癥的表現(xiàn)，而給予11β-HSD1基因敲除的小鼠高脂喂養(yǎng)，其體重增加和血脂的上升程度明顯低于對(duì)照〔4，5〕。這些資料提示11β-HSD1可能是導(dǎo)致肥胖伴高脂血癥發(fā)生的重要因素。

本文發(fā)現(xiàn)，肥胖癥模型大鼠肝臟中11β-HSD1 mRNA水平隨著大鼠體重、血脂和血壓的升高而升高，而脂蛋白酯酶mRNA水平卻下降，從分子機(jī)制上說(shuō)明11β-HSD1是導(dǎo)致高脂血癥和肥胖的一個(gè)有效因素；脂蛋白酯酶mRNA水平下降可能是由于高脂血癥、肥胖和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)導(dǎo)致脂蛋白酯酶mRNA含量降低，不能降解TG和其他脂類(lèi)，所以導(dǎo)致肥胖癥患者血脂升高。

ASP源于脂肪細(xì)胞，由脂肪細(xì)胞分泌的三種蛋白質(zhì)補(bǔ)體C3、因子B、因子D在補(bǔ)體旁路途徑中相互作用而生成。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖癥、糖尿病、冠心病患者血漿ASP顯著升高〔6〕，并且對(duì)兒童肥胖癥研究發(fā)現(xiàn)，血漿ASP與TG呈顯著正相關(guān)〔7〕。在C3基因敲除導(dǎo)致ASP缺乏的小鼠模型中，餐后TG和游離脂肪酸顯著升高〔8～10〕。因此，ASP在肥胖的脂代謝紊亂中也發(fā)揮促進(jìn)作用。但11β-HSD1及ASP在肥胖高脂血癥中的相互關(guān)系尚不明了。本文通過(guò)重組腺病毒11β-HSD1 siRNA載體構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建了腺病毒載體，又將載體通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細(xì)胞，隨著ASP溶液濃度的升高，未轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞活力逐漸上升，而轉(zhuǎn)染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細(xì)胞活力不變；細(xì)胞凋亡變化規(guī)律與細(xì)胞活性相反。因此我們認(rèn)為，ASP通過(guò)11β-HSD1基因片段對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響脂類(lèi)代謝。

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〔2015-11-15修回〕

(編輯徐杰)

武漢市衛(wèi)生局科技課題(WX13C16)

林梅(1970-)，女，博士，主要從事糖尿病、肥胖、甲狀腺疾病研究。

吳國(guó)瓊(1975-)，女，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病、肥胖、甲狀腺疾病等研究。

R589

A

1005-9202(2016)18-4435-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.014