老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后病理學變化與重要分子Shh mRNA的相關性

解錦鼎　安　寧　楊曉帆　曹文慧

(牡丹江林業中心醫院骨科，黑龍江　牡丹江　157000)

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老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后病理學變化與重要分子Shh mRNA的相關性

解錦鼎安寧1楊曉帆1曹文慧1

(牡丹江林業中心醫院骨科，黑龍江牡丹江157000)

目的探討老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后病理學變化與重要分子Shh mRNA的相關性。方法60只大鼠隨機分為慢性脊髓壓迫組(n=50)和對照組(n=10)，對照組椎板鉆孔，慢性脊髓壓迫組腹腔內麻醉，比較兩組脊髓損傷后不同時間點改良Tarlov評分及斜扳試驗變化、脊髓損傷后4 w病理組織學改變、脊髓損傷后Shh mRNA在距損傷區不同距離處表達。結果慢性脊髓壓迫組脊髓損傷后1、3 d、1、2、4 w的改良Tarlov評分均顯著低于對照組(P<0.05)，3 d、1、2、4 w的斜扳試驗也均顯著低于對照組(P<0.05)；慢性脊髓壓迫組灰質和白質細胞中Shh mRNA表達及分布范圍均顯著高于室管膜細胞(P<0.05)。結論老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷會激活重要分子Shh mRNA表達，進而對神經細胞再生產生重要作用。

慢性壓迫性脊髓損傷；重要分子Shh mRNA

現階段，臨床還很少有相關醫學學者有效研究神經細胞再生在中樞神經系統損傷后的分子機制，特別是老年大鼠脊髓損傷后。本研究探討了老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后與重要分子Shh mRNA的相關性。

1　材料與方法

1.1材料蘭州大學醫學實驗中心的60只1月齡雌雄Wistar大鼠，體質量300～350 g，平均(325.3±25.4)g。購買北京中山公司生產的Shh抗體、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、髓鞘堿性蛋白(MBP)及小鼠單克隆抗Shh、兔多克隆抗NSE、GFAP、MBP，工作濃度為1∶100。購買美國Sigma公司生產的Sigma Scan Pro 5.0圖像分析系統。

1.2動物模型的制作和分組隨機將60只大鼠分為慢性脊髓壓迫組(n=50)和對照組(n=10)兩組，給予對照組椎板鉆孔，給予慢性脊髓壓迫組腹腔內麻醉，采用10 g/L 40 mg/kg戊巴比妥鈉，常規消毒鋪巾，后正中切口切除T12棘突，椎板鉆孔，向T12椎板旋入塑料螺釘，直徑和螺距分別為3 mm和0.5 mm，定期將螺釘顯露出來，每3～5 d 1次，旋入螺釘0.25 mm，分別在1、3 d、1、2、4 w對側位X線片進行攝取，對椎管侵占率進行觀察，到4 w使一半脊髓受壓，完成壓迫后1、3 d、1、2、4 w分別隨機取材，每次5只。

1.3行為學檢查壓迫后1、3 d、1、2、4 w分別稱大鼠體重并進行行為學檢查，采用改良斜板試驗及Tarlov評分有效檢測大鼠行為及肢體運動功能，觀察大鼠傷后各時點后肢活動及肌力，從而對大鼠壓迫后的運動功能恢復情況進行有效評定〔1～3〕。

1.4病理標本制備在各時相點對慢性脊髓壓迫組大鼠、在損傷后4 w對照組大鼠進行腹腔麻醉，采用10 g/L、40 mg/kg戊巴比妥鈉，經左心室插管后將右心耳剪開，然后進行灌洗，灌洗過程中采用pH值為7.4的400 ml 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，待流出清亮的液體后進行灌注固定，灌注固定過程中采用pH值為7.4的40 g/L 0.1 mol/L PBS，30 min后將脊髓標本切取下來，該脊髓標本的長度為2 cm左右，中心為傷段，進行30 min的固定，固定環境為40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PBS，然后將200 g/L蔗糖溶液加入到pH值為7.4的40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/LPBS中，進行1 d的固定，包裹，包裹過程中用錫紙，然后將其在-70℃的冰箱中冷凍，將其有效保存進行HE染色及原位雜交〔4～6〕。

1.5免疫組化熒光技術檢測采用PBS進行3次漂洗，每次5 min，對細胞進行破膜，破膜應用Triton X-100，進行10～15 min的封閉，封閉應用BSA，一抗在4℃的溫度下進行2 d的孵育，用PBS進行3次漂洗，每次5 min；熒光二抗異硫氰酸熒光素(FITC)在4℃的溫度下孵育，過夜，用PBS進行3次沖洗，每次5 min；在37℃的溫度下對濃HCl溶液進行30 min DNA變性，用pH值為8.5的硼酸溶液在4℃的溫度下進行10 min的緩沖，用PBS進行3次沖洗，每次5 min。一抗在4℃的溫度下進行2 d的孵育，用PBS進行3次沖洗，每次5 min；熒光二抗四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)在4℃的溫度下孵育，過夜，進行3次沖洗，沖洗過程中用PBS，每次5 min。封片采用甘油緩沖液(PBS∶甘油=1∶1)，對免疫熒光染色神經細胞進行檢測，檢測運用平面共聚焦顯微鏡〔7～9〕。

1.6原位雜交檢測擴增并抽取純化質粒，有效標記檢測探針DNA，運用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統有效分析Shh mRNA原位雜交圖像。將視野中的陽性反應細胞隨機選取出來并對其進行半定量分析。其中高信號()具有較為強烈的信號表達，在灰質和白質中大量密集地分布；中等信號()具有顯著可見的信號表達，在灰質和白質中大量分布；低信號(+)具有較淡的表達，在灰質和白質中散在分布〔10～12〕。

1.7統計學方法采用SPSS20.0統計軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1兩組不同時間點改良Tarlov評分及斜扳試驗變化比較慢性脊髓壓迫組脊髓損傷后1、3 d、1、2、4 w改良Tarlov評分均顯著低于對照組(P<0.05)，3 d、1、2、4 w斜扳試驗也均顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1　兩組不同時間點改良Tarlov評分及斜扳試驗變化情況比較±s)

與對照組比較:1)P<0.05

2.2兩組4 w病理組織學改變慢性脊髓壓迫組壓迫后4 w鏡下見有衛星現象，脊髓灰質顯著水腫，無尼氏小體，具有顯著的噬神經元現象，白紙軸突周圍具有較大的間隙，軸突纖維具有較為紊亂的排列結構，具有顯著的變性水腫，片狀脫髓鞘區是其主要表現，且不規則，有空泡樣改變，炎性細胞浸潤及灶性出血壞死區顯著；見圖1。對照組脊髓結構破壞不顯著。

圖1　慢性脊髓壓迫組28 d脊髓組織(HE，×400)

2.3兩組Shh mRNA在距損傷區不同距離處的表達慢性脊髓壓迫組脊髓損傷后1 d具有較低的Shh mRNA表達，脊髓灰質是其表達的唯一場所；損傷后3 d損傷區遠端10 mm處具有最弱的Shh mRNA表達；損傷后1、2、4 w損傷區遠端10 mm處灰質和白質中均具有較高Shh mRNA表達。NSE陽性神經元細胞在所有時間點灰質中均很少出現Shh mRNA表達陽性細胞，白質中Shh mRNA陽性僅表達于MBP陽性少突膠質細胞中。Shh mRNA表達在GFAP陽性星型膠質細胞中呈陰性。灰質和白質細胞中Shh mRNA表達及分布范圍均顯著高于室管膜細胞(P<0.05)，損傷區周圍5 mm范圍內是其在室管膜區域的唯一表達場合，見表2；對照組無Shh mRNA表達，損傷區遠端1～10 mm處Shh mRNA陽性細胞分布強度均相似。

表2　慢性脊髓壓迫組Shh mRNA在距損傷區不同距離處的表達(n=50)

3　討　論

Shh參與體內多種發育過程,包括神經管定型、肢體發育、細胞表型定向誘導等。在神經系統發育中,Shh信號通路的主要作用為誘導整個中樞神經系統形成背腹兩側分區,當這一信號通路受到破壞時,將導致整個中樞神經系統腹側表型神經元完全喪失。Shh在脊髓腹側神經干細胞分化過程中也是一個非常重要的分子,在胚胎期的脊髓,Shh控制著神經細胞的增殖和分化,決定著細胞命運〔11〕。Shh的功能受體在神經干細胞中高度表達〔12〕,提示Shh信號分子對神經干細胞的增殖與分化起重要作用。Shh信號分子可以維持大腦中神經干細胞生存的微環境。本研究結果說明老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷會激活重要分子Shh mRNA表達，進而對神經細胞再生產生重要作用。

1楊亞林.紫杉醇對大鼠慢性脊髓損傷后膠質細胞的影響及其機制研究〔D〕.天津：天津醫科大學，2013.

2王凱.大鼠脊髓不同部位慢性壓迫病理變化的比較研究〔D〕.天津：天津醫科大學，2011.

3溫世鋒.3.0T MRI高信號DTI定量變化對脊髓型頸椎病轉歸的預測及其相應的病理機制〔D〕.廣州：南方醫科大學，2013.

4王培鑫.MRI信號比值與神經細胞凋亡相關性的研究〔D〕.石家莊：河北醫科大學，2012.

5宗會遷.頸髓壓迫性損傷的磁共振擴散張量成像實驗和臨床研究〔D〕.石家莊：河北醫科大學，2010.

6李利軍，宋潔富，魏杰，等.慢性壓迫性脊髓損傷后骨骼肌形態學及相關蛋白Myogenin和myoD表達的實驗研究〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版)，2010；4(9)：1691-4.

7李延宏，楊同群，王秉義，等.慢性脊髓損傷后caspase3及凋亡細胞的研究〔J〕.甘肅醫藥，2013；32(3)：161-3.

8袁鳳祥，安春厚.構建脊髓慢性壓迫損傷模型大鼠巢蛋白的表達規律〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2011；15(37)：6866-70.

9王巖峰，秦光華，楊明超，等.LY-294002對大鼠急性脊髓損傷后Bcl-2表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(7)：1566-8.

10田小磊，王坤，靳安民.內質網應激相關蛋白在大鼠急性脊髓損傷中的表達及其意義〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(20)：5796-8.

11Long HQ，Xie WH，Chen WL，etal.Value of Micro-CT for monitoring spinal microvascular changes after chronic spinal cord compression〔J〕.IJMS，2014；15 (7)：12061-73.

12Ruiz Picazo D，Ramírez Villaescusa J，Portero Martínez E，etal.Late collapse osteoporotic vertebral fracture in an elderly patient with neurological compromise〔J〕.Eur Spine J，2014；23(12)：2696-702.

〔2015-12-31修回〕

(編輯苑云杰)

安寧(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事神經病學研究。

解錦鼎(1982-)，男，碩士，主治醫師，主要從事脊髓損傷研究。

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A

1005-9202(2016)18-4440-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.016

1牡丹江醫學院紅旗醫院神經內科