EDNRA和EDNRB基因單核苷酸位點多態性與缺血性腦卒中的相關性

房雅楠　隋汝波

(錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧　錦州　121001)

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EDNRA和EDNRB基因單核苷酸位點多態性與缺血性腦卒中的相關性

房雅楠隋汝波

(錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧錦州121001)

目的探討中國北方地區漢族人群內皮素受體(EDNR)A和EDNRB基因中單核苷酸多態性(SNP)與缺血性腦卒中(IS)的相關性。方法檢測EDNRA基因的3個位點：rs1801708、rs5333、rs5335和EDNRB基因的2個位點：rs3818416、rs5351在對照組、IS組中的多態分布。結果在男性群體中，EDNRA基因rs5335位點突變純合型CC發病危險度明顯降低(P=0.016；OR=0.52；95%CI=0.31～0.88)；在女性群體中，EDNRA基因rs1801708位點中，突變純合型AA發病危險度明顯高于G基因攜帶者(P=0.019；OR=2.65；95%CI=1.18～6.00)。結論EDNRA基因rs5335位點的C等位基因能夠降低北方漢族男性人群IS的發病風險，rs1801708位點的A等位基因能夠增加北方漢族女性人群IS的發病風險。

缺血性腦卒中；EDNRA基因；EDNRB基因；單核苷酸多態性(SNP)

研究表明，內皮素(EDN)-1〔1〕在原發性高血壓、腎小球硬化、動脈粥樣硬化、心力衰竭等疾病發生中起重要作用〔2〕，與缺血性腦卒中(IS)〔3〕也有很大關系。內皮素受體(EDNR)A介導血管收縮和細胞增殖，而EDNRB介導ET-1清除、內皮細胞存活、一氧化氮(NO)和前列環素(PGI2)釋放。EDNRA和EDNRB對血管擴張的作用是相反的〔4〕。對EDNRA基因多態性的研究發現，其rs5333(His323His)與男性平均頸動脈內中膜厚度顯著相關〔5〕，rs5335與肺功能〔6〕以及高血壓有關。EDNRB的rs5351多態性與男性上臂-腳踝間的脈搏波傳導速度(BAPWV)顯著相關〔5〕。本研究分析EDNRA(rs1801708、rs5333、rs5335)、EDNRB(rs3818416、rs5351)位點基因型和等位基因在IS中的頻率分布差異，從信號通路的角度探索EDN系統基因多態性與中國北方漢族人群IS的相關性。

1　對象與方法

1.1研究對象(1)病例組選取錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科2015～2016年就診的患者，彼此無血緣關系，全部病例經詳細詢問病史、體格檢查以及參照頭部CT或MRI檢查結果，均符合國際疾病分類第10版(ICD10)的IS診斷標準，均屬于IS分型(TOAST)中的大血管性IS。共381例患者，男236例，女145例，年齡29～88〔平均(62.22±10.81)〕歲，體重指數(BMI)(24.27±3.90)kg/m2。(2)對照組為醫院同期其他臨床科室無遺傳性疾病、無神經系統疾病及急慢性炎癥的住院病人，共366例，男225例，女141例，年齡26～87〔平均(61.47±9.64)〕歲,BMI(24.3±3.18)kg/m2。病例組與對照組年齡、性別比例和體重指數比較均無顯著差異(P>0.05)，而高血壓病史、吸煙史和飲酒史存在顯著差異(P<0.05)，見表1。高血壓標準：收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg，或高血壓病史并服用降壓藥病史；糖尿病標準：空腹血糖≥7.0 mmol/L、隨機血糖≥11.1 mmol/L或有糖尿病史并服用降糖藥史；高血脂癥：空腹血清總膽固醇(TC)≥5.72 mmol/L、甘油三酯(TG)≥1.70 mmol/L；吸煙史：吸煙超過2年、吸煙量3～40支/d。全部研究對象經醫院倫理委員會同意，簽署知情同意書。

1.2方法(1)血樣采集：乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，抽取研究對象外周靜脈血5 ml。(2)基因組DNA制備：采用Qiagen全血基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書操作。(3)單核苷酸多態性(SNP)分型：采用SNaPshot SNP分型技術對所選5個SNP位點進行分型。用在線Primer3軟件設計5對PCR擴增引物和SNP多重單堿基延伸引物。PCR引物序列：EDNRA基因rs1801708位點引物，正義：5′CGTACAGTCATCCCGCTGGTCT3′,反義：5′CACAGCTTCCCCGGCTTCA3′；rs5333位點引物，正義：5′GCGTCGAGAAGTGGCAAAAACA3′，反義：5′AGGAGGGGAGGGGCAAGATAAC3′；rs5335位點引物，正義：5′AACACAGACCGGAGCAGCCATA3′，反義：5′GGGTGTGGGAGTGAATTAAGGAAGAA3′；EDNRB基因rs3818416位點引物，正義：5′CGTTGGAGAATCGGACCTGACA3′，反義：5′CCACTCAGAAGTGTTTCCATCGATCT3′；rs5351位點引物，正義：5′AAAAATGCAGTGATGGCCAATG3′，反義1：5′TGTTCAGTAAGTGTGGCCTGAARGA3′，反義2：5′TGGGTGGTCTCTGTGGTTCTGG3′。SNaPshot多重單堿基延伸引物：rs1801708位點TTTTTTTTTTGCTTCCCCGGCTTCAGAAAAC，rs5333位點TTTTTTTCACAGTTTTCTTCAATATACGGCTTAA，rs5335位點TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGGATCAGAG AAGAGATTCCCGGA，rs3818416位點TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGSGGGGGTATGAAGAACACTGGG，rs5351位點TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTACAAGACAGCAAAAGRTTGGTGKCT。PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，PCR產物經蝦堿酶(SAP)(from Promega) 和外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ)(from Epicentre)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用SAP純化后在ABI3130xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)分析。

1.3統計學方法Hardy-Weinberg平衡檢驗選取樣本的代表性。應用SPSS17.0軟件，位點基因型頻率和等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸分析疾病危險因素，以比值比(OR)及95%可信區間(CI)表示相對危險度。

2　結　果

2.1SNP位點基因型分布將篩選的2個基因5個SNP位點進行SNaPshot分型后，經Hardy-Weinberg平衡檢驗發現，rs5351位點的基因頻率分布在對照組中處于臨界值(P=0.061)，因此，認為此位點在對照組中遺傳不平衡，后續不對該位點進一步分析。其余位點對照組均符合平衡，說明所選樣本具有良好的人群代表性。見表2，表3。

表2　SNP位點rs1801708、rs5333、rs5335基因型分布及H-W平衡檢驗〔n(%)〕

表3　SNP位點rs3818416、rs5351基因型分布及H-W平衡檢驗〔n(%)〕

2.2基因型與疾病的相關性分析Logistic回歸分析過程中發現，在不同性別群體中位點多態性與疾病發生有關，所以實驗結果以性別分層分析為主。EDNRA基因rs5335位點基因型CC個體發病危險度明顯低于T基因攜帶者(P=0.016；OR=0.52；95%CI=0.31～0.88)，男性群體中其余位點多態性與疾病發生無顯著相關。在女性群體中，EDNRA基因rs1801708位點中，AA基因型個體發病危險度明顯高于G等位基因攜帶者(P=0.019；OR=2.65；95%CI=1.18～6.00)，其余位點多態性與疾病發生無相關性。見表4，表5。

表4　男性群體中SNP位點多態性與疾病發生相關性〔n(%)〕

表5　女性群體中SNP位點多態性與疾病發生相關性〔n(%)〕

3　討　論

EDN1是迄今為止發現的最強有力的縮血管因子，EDN1主要通過下游的兩個 G 蛋白偶聯受體EDNRA 和EDNRB發揮作用。血管平滑肌細胞EDNRA 激活后可介導血管平滑肌收縮及增殖，而EDNRB作用恰恰相反，EDNRA 1激活后可促進NO、PGI2等血管舒張劑的釋放，加快EDN1在肺臟、腎臟及肝臟的清除；EDNRB 2亦位于血管平滑肌細胞，其縮血管作用在機體正常狀態下較弱，但在高血壓、動脈粥樣硬化等病理狀態下作用尤為突出〔6〕。目前研究認為，EDN1是高血壓的一個重要危險因素。Schiffrin等〔7〕第一次揭示了高血壓患者的血管壁存在EDN1基因的過度表達，并推測這種現象可能在血壓升高和血管增生過程中發揮了重要作用。之后，相關研究發現，EDN1的Lys198Asn多態性與肥胖個體的高血壓發病相關〔8〕。最近，在白人中進行的一項EDN1和EDNRA與肺動脈高血壓相關性研究表明，在單變量分析中，心導管插入時，EDNRA His323His TT基因型患者心臟指數較低，肺血管阻力指數較高。結果顯示，EDNRA基因多態性可能與肺動脈高血壓易感性有關〔9〕。

IS是一個復雜的多基因遺傳病，由遺傳因素和環境共同作用產生。目前研究者認為，IS有多種危險因素，其中，高血壓是其主要的危險因素之一。研究表明，高血壓、動脈粥樣硬化以及血小板增多均與IS的發生發展密切相關〔10〕。2005年，Gormley等〔11〕選取EDN1基因(K198N)、EDNRA(-231G>A，+1222C>T)以及 EDNRB(G57S，L277L)位點，對300名小血管病例和600名正常人群進行基因分型和單體型分析，結果沒有發現病例組和對照組的SNP多態性或單體型之間有顯著差異。認為EDN系統基因多態性不是小血管病的危險因素。2009年，MacClellan等〔12〕研究了15～49歲的297例IS女性和422例健康白人女性EDN1、EDNRB和NOS3基因多態性，他們發現，EDN1基因rs1800542位點A等位基因攜帶者比GG純合子攜帶者患IS的風險高2倍多。EDNRB 基因rs4885493和rs10507875多態性與IS顯著相關。

本研究結果顯示，男性群體中，EDNRA基因rs5335位點基因型中，CC個體發病危險度明顯低于T基因攜帶者。男性群體中其余位點多態性與疾病發生無顯著相關。可以認為，EDNRA基因rs1801708位點AA基因型是中國北方漢族女性個體IS發病的危險因素。目前認為，EDN系統與已知的IS危險相關通路，如NO信號通路、腎素-血管緊張素系統(RAS)等進行互作，因此EDN系統基因的變異可能是IS重要的致病因素。

1Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，etal.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells〔J〕.Nature,1988;332(6163)：411-5.

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3杭麗瑋，周建中，王珍，等.內皮素-1基因多態性與高血壓缺血性卒中的關系〔J〕.西南大學學報(自然科學版)，2009；31(1)：116-21.

4Mazzuca MQ，Khalil RA.Vascular endothelin receptor type B：structure，function and dysregulation in vascular disease〔J〕.Biochem Pharmacol，2012；84(2)：147-62.

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6Darrah R，McKone E，O′Connor C，etal.EDNRA variants associate with smooth muscle mRNA levels，cell proliferation rates，and cystic fibrosis pulmonary disease severity〔J〕.Physiol Genomics,2010；41(1)：71-7.

7Schiffrin EL，Deng LY，Sventek P，etal.Enhanced expression of endothelin-1 gene in resistance arteries in severe human essential hypertension〔J〕.J Hypertens，1997；15(1)：57-63.

8Barath A，Endreffy E，Bereczki C，etal.Endothlin-1 gene and endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms in adolescents with juvenile and obesity-associated hypertension〔J〕.Acta Physiol Hung，2007；94(1-2)：49-66.

9Calabro P，Limongelli G，Maddaloni V，etal.Analysis of endothelin-1 and endothelin-1 receptor A gene polymorphisms in patients with pulmonary arterial hypertension〔J〕.Intern Emerg Med,2012；7(5)：425-30.

10孫吉.miRNA-146a和EPHX2基因多態性與長沙地區漢族人群缺血性腦卒中遺傳易感性的關聯研究〔D〕.長沙：中南大學，2011.

11Gormley K，Bevan S，Hassan A，etal.Polymorphisms in genes of the endothelin system and cerebral small-vessel disease〔J〕.Stroke，2005；36(8)：1656-60.

12MacClellan LR，Howard TD，Cole JW，etal.Relation of candidate genes that encode for endothelial function to migraine and stroke：the Stroke Prevention in Young Women study〔J〕.Stroke，2009；40(10)：e550-7.

〔2016-01-19修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of SNP polymorphisms of EDNRA and EDNRB gene on ischemic stroke

FANG Ya-Nan,SUI Ru-Bo.

Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,Liaoning,China

ObjectiveTo investigate the association between SNP polymorphisms of endothelin receptor (EDNRA and EDNRB) gene and ischemic stroke (IS) in the Chinese Han population in northern.MethodsThe SNPs,including rs1801708,rs5333,and rs5335 in EDNRA gene and rs3818416 and rs5351 in EDNRB gene,were analyzed and calculated their polymorphic distribution.ResultsIn male population,EDNRA gene mutation rs5335 homozygous CC morbidity risk was significantly lower (P=0.016;OR0.52; 95 %CI0.31～0.88).In the female population,the mutant homozygous AA cancer risk was significantly higher than G allele carriers (P=0.019;OR2.65;95%CI1.18～6.00) on ENDRA gene rs1801708.ConclusionsIn EDNRA gene,C allele of rs5335 might reduce the IS incidence risk factors in Northern Han male population.A allele of rs1801708 in EDNRA gene could increase the risk of IS in Northern Han women population.

Ischemic stroke;EDNRA receptor;EDNRB receptor;SNP

國家自然科學基金(No.81371461)

隋汝波(1971-)，男，博士，主任醫師，碩士生導師，主要從事腦血管疾病研究。

房雅楠(1993-)，女，碩士，主要從事腦血管疾病研究。

R743

A

1005-9202(2016)18-4446-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.019