miRNA-141在老年直腸癌患者中的表達及其與臨床病理特征的關系

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(河北醫科大學第四醫院腫瘤內科，河北　石家莊　050011)

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miRNA-141在老年直腸癌患者中的表達及其與臨床病理特征的關系

馮莉范志松常靚韓晶王玉棟左靜周欣亮王貴英1

(河北醫科大學第四醫院腫瘤內科，河北石家莊050011)

目的探討miRNA-141在直腸癌中的表達及其與臨床病理特征的關系。方法75例直腸癌患者以及正常體檢者40例納入本次研究，收集受試者直腸癌組織及癌旁正常組織，抽取直腸癌患者及正常體檢者肘靜脈血，應用實時聚合酶鏈法檢測75例直腸癌樣本中miRNA-141的表達，分析直腸癌和血液miRNA-141表達與臨床病理特征的關系。結果①直腸癌患者外周血和直腸癌組織miR-141的表達水平均較正常體檢者顯著降低(P<0.01)；② 直腸癌組織和外周血miRNA-141表達與腫瘤分期、腫瘤分化程度和有無淋巴結轉移有關(P<0.01)。結論miRNA-141可能參與直腸癌發生、發展，其低表達可能與直腸癌的分化和轉移有關。

微小RNA；直腸癌

腫瘤與細胞增殖、分化、凋亡調控異常密切相關。微小RNA(miRNA)是由20～25個核苷酸組成的非編碼小RNA，可抑制miRNA 的翻譯，并誘導miRNA的切割降解，參與細胞分裂、增殖、分化等生物學過程，具有著類似癌基因和抑癌基因的功能，在腫瘤的發生、進展過程中發揮著重要作用〔1,2〕。本文對直腸癌患者血清和癌組織miRNA-141的表達進行檢測，旨在研究miRNA-141在直腸癌中的作用。

1　材料與方法

1.1臨床資料2014年1～12月在本院普通外科收治的初診直腸癌患者75例納入本次研究。納入標準：(1)年齡≥60歲；(2)所有患者均經過組織病理學確診；(3)未經放療或化療治療。75例患者中男43例(57.33%)、女32例(42.67%)；年齡60～72歲，平均(65.26±6.52)歲；腫瘤直徑2.4～7.3 cm，平均(4.63±1.58)cm；腫瘤TNM分期Ⅰ期13例(17.33%)、Ⅱ期31例(41.33%)、Ⅲ期24例(32.00%)、Ⅳ期7例(9.34%)；黏膜下層浸潤46例(61.33%)、黏膜層浸潤29例(38.67%)；距肛緣距離≥5 cm 40例(53.33%)，距肛緣距離<5 cm 35例(46.67%)；高度分化16例(21.33%)、中度分化23例(30.67%)和低度分化36例(48.00%)；無淋巴結轉移31例(41.33%)、有淋巴結轉移44例(58.67%)。按照年齡和性別配比選取同期在本院體檢中心健康體檢正常的受試者40例作為對照組，年齡60～75歲，平均(66.45±5.96)歲；男22例(55.00%)、女18例(45.00%)。兩組受試者年齡和性別均無統計學差異(P>0.05)。本研究得到本院倫理委員會批準，并且所有受試者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑mirVanaTMPARISTM miRNA 試劑盒，美國Applied Biosystems提供；FAST1000試劑盒，北京先鋒生物公司提供；Affymetrix 逆轉錄試劑盒，由美國Qiagen 公司提供；Micrornas Real-time PCR Assay kit，由北京艾德萊生物科技公司；miRNA-141及內參U6引物設計與合成由北京艾德萊生物科技公司提供，miRNA-141的引物序列5'- CCGGTAACACTGTCTGGTAA-3'，內參U6的引物序列為5'- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'。

1.3主要儀器紫外可見分光光度儀，德國Eppendorf公司提供；ABI step one熒光定量PCR儀，美國ABI公司提供；GeneGenius全自動凝膠成像系統，美國Syngene公司。

1.4方法提取受試者外周血和直腸標本的RNA，采用實時聚合酶鏈法(RT-PCR)測定直腸病理組織。

1.4.1RNA提取抽取受試者空腹肘靜脈血5 ml，室溫下靜置30 min，待血液完全凝固后離心分離血清。取血清采用mirVanaTMPARISTM miRNA試劑盒提取總RNA。直腸組織RNA提取采用FAST1000試劑盒進行。稱取100 mg直腸癌組織或癌旁正常組織并加入裂解液，研磨，吸取裂解液后加入氯仿進行混勻，離心，加入聚合液并轉移至內套管，洗脫液洗脫2次，高速離心，將內套管移入EP內，膜中央加洗脫液RNase-free H2O，靜置，離心，即得。所得RNA 經紫外分光光度法測定濃度，吸光度A260 nm/A280 nm為1.8 ～ 2.1的RNA樣品于-80℃保存。

1.4.2RT-PCR采用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit，以總RNA為模板，采用miR-141 特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應得cDNA。逆轉錄條件：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min。將逆轉錄所得cDNA純化后應用Micrornas Real-time PCR Assay kit在ABI step one熒光定量PCR儀進行PCR擴增。反應總體積為20 μl∶1.5 μl cDNA 模板，1 μl miR-141或U6引物，10 μl miRNA qPCR Mix，7.5 μl H2O。PCR反應條件:94℃預變性3 min，然后94℃ 20 s、60℃ 20 s和72℃ 40 s，40 個循環。以U6 為內參基因，采用2-ΔΔCt計算miR-141 的相對定量表達水平。

1.5統計學處理使用SPSS13.0軟件進行t檢驗、方差分析及χ2檢驗。

2　結　果

2.1miR-141的表達直腸癌患者直腸癌組織miR-141表達水平(5.13±0.62)較癌旁正常組織(8.67±0.95)顯著降低(t=27.025，P=0.000)；直腸癌患者外周血miR-141水平(3.54±0.44)較正常體檢者(6.24±0.76)顯著降低(t=20.409，P=0.000)。

2.2miR-141表達與直腸癌臨床病理關系的單因素分析直腸癌組織和血液miR-141表達與年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤程度、距肛緣距離無明顯相關性(P>0.05)；但是隨著患者腫瘤分期增大，直腸癌組織和血液miR-141表達降低(P<0.01)；隨著患者腫瘤分化程度降低，直腸癌組織和血液miR-141表達降低(P<0.01)；有淋巴結轉移的患者較無淋巴結轉移的患者直腸癌組織和血液miR-141表達降低(P<0.01)。見表1。

表1　miR-141表達與直腸癌臨床病理特征的關系±s)

3　討　論

miRNA是一系列廣泛存在于動、植物中與基因表達調控相關的非編碼小分子單鏈RNA〔3〕。miRNA為單股、長20～24 個核苷酸短序列，3′端可以有1～2個堿基的長度變化。近年來研究表明，在人類基因組中大約有900 多種獨特的miRNA，并且1/3的基因由miRNAs 調控〔4〕。miRNA使mRNA的3'UTR區域完全或不完全配對來執行對靶基因的切割或者翻譯的抑制功能，從而調節基因的表達〔5,6〕。miRNAs 在人類及動物的各種生理及病理過程中起重要作用，它們可以參與控制一些生物過程，包括細胞生長、凋亡、發育、新陳代謝、壓力調適、激素信號通路和分化等〔7〕。miRNAs 可以根據細胞狀態及不同的靶基因來決定作為癌基因或者抑癌基因，其可在多種癌癥的診斷、預后及治療中發揮重要作用〔8〕。miRNA-141是miRNA家族的成員，通過調節不同的信號通路，在生理狀態和疾病發生、發展過程中發揮重要作用。miR-141 與子宮癌、前列腺癌、肝細胞肝癌、腎透明細胞癌及子宮內膜癌等的發病機制密切相關〔9,10〕。但是關于miR-141在直腸癌發病中的作用尚不完全明確。

本研究結果提示miR-141與直腸癌的發生有一定關系，血漿miR-141水平與患者短期生存率密切相關，并且可獨立作為結直腸癌預后的指標〔11〕。

1Lam TK，Shao S，Zhao Y，etal.Influence of quercetin-rich food intake on microRNA expression in lung cancer tissues〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012;21(12)：2176-84.

2Kroh EM，Parkin RK，Mitchell PS，etal.Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR)〔J〕.Methods，2010;50(4)：298-301.

3Small EM，Frost RJ，Olson EN，etal.MicroRNAs and new dimension to cardiovascular diseases〔J〕.Circulation，2010;121(18)：1022-121.

4Kim VH，Han J，Siomi MC.The Biogenesis of small RNAs in animals〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2009;10(2)：126-39.

5Davalos V，Esteller M.MicroRNAs and cancer epigenetics：a macroevolution〔J〕.Curr Opin Oncol，2010;22(1)：35-45.

6Lin PY，Yu SL，Yang PC.MicroRNA in lung cancer〔J〕.Br J Cancer，2010;103(8)：1144-8.

7Gangaraju VK，Lin H.MicroRNAs：key regulators of stem cells〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2009;10(2)：116-25.

8Iorio MV，Croce CM.MicroRNAs in cancer:small molecules with a Huge impact〔J〕.J Clin Oncol，2009;27(34):5848.

9Lee TS，Jeon HW，Kim YB，etal.Aberrant mircroRNA expression in endometrial carcinoma using formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissues〔J〕.PLoS One，2013;8(12)：e81421.

10Gonzales JC，Fink LM，Goodman Jr OB，etal.Comparison of circulating MicroRNA 141 to circulating tumor cells，lactate dehydrogenase，and prostate- specific antigen for determining treatment,the response in patients with metastatic prostate cancer〔J〕.J Clin Genitourin Cancer，2011;9 (1)：39-45.

11Cheng H，Zhang L，Cogdell DE，etal.Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis〔J〕.PLoS One，2011;6(3)：e17745.

〔2015-11-13修回〕

(編輯李相軍)

河北省衛生廳醫學科學研究重點課題(No.20150769)

王貴英(1969-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事消化道腫瘤研究。

馮莉(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事消化道腫瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2016)18-4498-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.046

1河北醫科大學第四醫院外二科