姜黃揮發油對黑色素瘤wm9細胞增殖與凋亡的影響*

葉振源，涂云華，薛月萃，榮冬蕓，昝雪娟，潘軍玲，曹　煜

(貴州醫科大學附屬醫院皮膚性病科　550004)

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論著·基礎研究

姜黃揮發油對黑色素瘤wm9細胞增殖與凋亡的影響*

葉振源，涂云華，薛月萃，榮冬蕓，昝雪娟，潘軍玲，曹煜

(貴州醫科大學附屬醫院皮膚性病科550004)

目的研究姜黃揮發油對黑色素瘤wm9細胞增殖與凋亡的影響。方法應用不同濃度的姜黃揮發油作用于黑色素瘤的wm9細胞。用細胞增殖計數試劑盒(CCK8)檢測增殖抑制率，倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化，ELISA法檢測Caspase-3酶活性，流式細胞檢測細胞周期和凋亡。結果姜黃揮發油在不同濃度下，對黑色素瘤wm9細胞作用表現不同，當藥物濃度達到40 mg/L，倒置顯微鏡下可見到典型的凋亡細胞；Caspase-3酶活性隨著藥物濃度的遞增，呈現藥物濃度-酶活性正相關性；經姜黃揮發油作用后的wm9細胞被阻滯在G2/M期。結論 姜黃揮發油誘導黑色素瘤wm9細胞凋亡的機制與細胞周期G2/M期阻滯、Caspase酶活化參與凋亡有關。

凋亡；增殖；姜黃揮發油；wm9細胞

黑色素瘤是來源于皮膚及其他器官黑素細胞產生的惡性腫瘤，近年來研究結果顯示中國發病率為0.53/10 0000，且隨年齡增加而增加[1]。本病惡性程度較高，轉移發生早，病死率高，因此及時治療很重要。目前治療方式包括手術治療和藥物治療。藥物方面化療藥物仍然是臨床一線治療的首選[2]，但其在殺死腫瘤細胞的同時，也對正常細胞造成了影響，從而導致了一系列不良反應。姜黃是芭蕉目和姜科類植物，在臨床上有降血脂、抗氧化、免疫調節等作用[3-5]，且不良反應少，有較大的臨床應用價值，姜黃揮發油主要通過氣相色譜-質譜從姜黃植物提取[6]。本實驗主要研究姜黃揮發油對黑色素瘤wm9細胞增殖、凋亡的影響，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料與試劑姜黃揮發油(貴陽舒美達藥廠有限公司，以100∶1比例與二甲基亞砜混合，使藥物充分溶解，稀釋至1 mg/mL，濾過除菌，置于4 ℃冰箱存放)，黑色素瘤wm9細胞(貴州中國科學院天然產物化學重點實驗室贈予)，胎牛血清(杭州四季青有限公司)，RPMI1640培養基(上海浩然生物技術有限公司)，CCK8(上海前塵生物科技有限公司)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX53-A12PH)，Caspase-3酶試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)，BD FACS Verse流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)，ELX800酶聯免疫檢測儀(美國Biotech公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養黑色素瘤wm9用RPMI1640培養基(含1%青霉素、1%鏈霉素雙抗、10%胎牛血清)，置于5%CO2恒溫37 ℃條件下，飽和濕度培養箱中培養，每2天傳代1次，待細胞進入對數生長期。

1.2.2細胞增殖抑制率檢測在96孔板中加入100 μL的細胞懸液，并調整其細胞密度為2.0×105/mL將培養板置于37 ℃ 5%CO2培養箱培養24 h,向培養板加入不同濃度的姜黃揮發油，參考涂云華濃度梯度方法[7]，最終使其濃度分別到5、10、20、40 mg/L，同時設置細胞對照組和空白對照組,且每孔設6個復孔，將培養板在培養箱孵育24、48、72 h，在培養結束時間前1.5 h向每孔加入10 μL CCK8溶液，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值(A值)，細胞增殖抑制率(%)=(對照組-實驗組)/(對照組-空白對照組)×100%。

1.2.3細胞形態學觀察取處于對數生長期的細胞，用RPMI1640培養基調整使其對數生長期細胞密度為1.5×105/mL，

表1　　姜黃揮發油作用WM9細胞增殖抑制率比較±s)

*：P<0.05，與對照組比較；-：此項無數據。

接種于6孔板，置于5%CO237 ℃的培養箱中，培養12 h孵育過夜，分別加入終濃度為5、10、20、40 mg/L姜黃揮發油培養液，對照組則加入10%FBS RPMI1640培養基同步培養，置于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養48 h，觀察細胞形態變化。

1.2.4Caspase-3酶活性檢測取處于對數生長期的黑色素瘤wm9細胞，調整細胞密度為1×105/mL，接種于6孔板，每孔1 mL，培養12 h，加入不同體積藥物，總體積為2 mL，使其終濃度為5、10、20、40 mg/L，同時設細胞對照組，培養48 h，胰酶消化，離心收集細胞，取50 μL裂解液加入，均勻吹打，置冰上裂解30 min，其間渦旋振蕩3～4次，每次10 s，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，將上清液轉移到96孔板中，按照Caspase-3酶活性檢測試劑盒使用說明書操作方法，取細胞提取液5 μL，加入含熒光底物Ac-DEVD-AMC的Caspase-3反應緩沖液每孔45 μL，37 ℃避光，孵育4 h，用酶標儀在波長為460 nm測定A值。Caspase-3活化程度=實驗組A460/正常對照A460。

1.2.5細胞周期測定細胞培養方法同1.2.4，加入不同體積藥物，使其終濃度分別為5、10、20、40 mg/L，總體積2 mL，同時設細胞陰性對照組，并收集細胞，培養48 h，用PBS洗滌細胞1次(2 000 r/min離心5 min)，使其細胞濃度為1×106/mL，離心后去除上清液，加入70%乙醇500 μL固定2 h，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液,加入100 μL RnaseA 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上機檢測。

1.2.6細胞凋亡檢測細胞培養方法同1.2.4，加入姜黃揮發油，藥物濃度設置同1.2.4，總體積2 mL，設置細胞對照組，培養48 h，4 ℃離心5 min收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，4 ℃離心5 min，調整使其細胞濃度1×105/mL，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution 輕輕混勻。避光、室溫10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，用BD FACS Verse流式細胞儀測定細胞凋亡。

2　結　　果

2.1細胞增殖抑制率檢測不同濃度姜黃揮發油作用黑色素瘤wm9細胞不同時間段后，均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增高，抑制率呈增高趨勢，且其作用方式呈現時間-劑量相關性。作用48 h時，增殖抑制作用較為明顯，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2細胞形態學觀察正常黑色素瘤wm9呈多種細胞形態，貼壁生長，細胞核呈圓形或橢圓形，深染，核仁小、核漿豐富，胞質少。加入藥物后，細胞形態不規則，細胞間隙增大，細胞增殖速度明顯變慢。當藥物濃度濃度達到20 mg/L，細胞核固縮，部分腫瘤細胞膜開始破裂，可見部分細胞內容物釋放，當藥物濃度達到40 mg/L，已不能見到正常腫瘤細胞結構，可見大量的細胞碎片。見圖1。

A:對照組；B：5 mg/L姜黃揮發油處理細胞；C:10 mg/L姜黃揮發油處理細胞；D：20 mg/L姜黃揮發油處理細胞；E：40 mg/L姜黃揮發油處理細胞。

圖1不同濃度姜黃揮發油對wm9細胞形態變化的影響(×200)

2.3Caspase-3酶活性檢測姜黃揮發油對黑色素瘤wm9具有促凋亡作用，且隨著藥物濃度的增加，呈藥物濃度-酶活性正相關，當藥物濃度濃度達到40 mg/L，此時酶活性達到最大值。見表2。

表2　　不同濃度姜黃揮發油作用wm9細胞

*：P<0.05，與對照組比較；-：此項無數據。

2.4細胞凋亡檢測姜黃揮發油作用于細胞48 h后，黑色素瘤wm9細胞均有不同程度的凋亡，隨著藥物濃度的增加，凋亡率亦增加，呈現藥物濃度-凋亡率正相關性，早期凋亡率分別為(12.30±0.01)、(11.95±0.04)、(14.63±0.12)、(25.74±0.20)%，晚期凋亡率(10.18±0.02)、(13.74±0.13)、(35.68±0.21)、(58.14±0.13)%。早期凋亡率和晚期凋亡率在藥物濃度為40 mg/L達到最大值，且在同等藥物濃度下，晚期凋亡率較早期凋亡率更高，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A:自然凋亡；B～E：藥物濃度分別5、10、20、40 mg/L。

圖2不同濃度姜黃揮發油誘導wm9細胞凋亡

2.5細胞周期檢測細胞周期檢測發現G1、S期細胞隨著藥物濃度的增高，細胞數目呈現遞減趨勢，呈現藥物-細胞數目負相關性。而G2期細胞隨著藥物濃度的增高，該期細胞數目呈現遞增趨勢。見圖3。

A:對照組；B～E：藥物濃度分別5、10、20、40 mg/L。

圖3不同濃度姜黃揮發油對細胞周期的影響

3　討　　論

姜黃為姜科植物姜黃的干燥根莖，作為一種中藥在現代研究廣泛，現在對其藥理作用已做了相關的研究，表明其在腫瘤、慢性肝病、腎病、糖尿病、皮膚病等疾病的治療上有一定的優勢[8]。其中姜黃的主要成分姜黃素對于抗腫瘤已有相關研究，如乳腺癌、結腸癌[9-10]。姜黃的另一種成分姜黃揮發油在抗腫瘤方面的研究卻鮮有報道，相關文獻表明姜黃揮發油對抗急性單核細胞白血病THP-1細胞具有增殖抑制劑促凋亡作用[7]，然而對于其抗黑色素瘤細胞方面尚無研究。

本研究主要探討姜黃揮發油對于黑色素瘤wm9細胞的作用效果。實驗研究結果表明，姜黃揮發油對于黑色素瘤wm9細胞生長具有抑制作用，且隨著藥物濃度的遞增，其抑制作用越明顯，呈現時間-濃度相關性，當藥物濃度為40 mg/L，其對細胞的抑制作用最明顯。Caspase是凋亡信號通路中重要的蛋白酶之一，也是與凋亡密切相關的調節基因，在細胞凋亡過程中與其他蛋白共同作用調控細胞的凋亡[11]，而Caspase-3能夠切割不同的底物，經激活后能剪切細胞結構蛋白和抑制DNA修復作用，同時參與凋亡啟動和凋亡程序執行，從而導致細胞死亡，是其最重要的關鍵凋亡調節基因和終末執行酶[12]。實驗結果顯示，隨著藥物濃度遞增，酶活性增加，表明藥物對其有促凋亡作用。流式細胞儀用于檢測細胞周期與細胞凋亡，細胞周期調控是一個精細的生物學過程，涉及了多個基因和蛋白的參與，進而形成了復雜的信號分子網絡系統，而惡性腫瘤最基本的生物學特征是腫瘤細胞失控性增殖，而其生物學基礎是細胞周期調控紊亂[13]。本實驗結果表明，G1、S期細胞隨著藥物濃度增加，細胞數目遞減，而G2期細胞隨著藥物濃度的增高，細胞數目呈遞增趨勢，表明細胞被阻滯在G2/M期，從而干擾了正常細胞周期，阻斷了細胞正常有絲分裂，再次論證了姜黃揮發油對于黑色素瘤wm9的增殖抑制作用。

綜上所述，姜黃揮發油誘導凋亡的機制與細胞周期G2/M期阻滯、Caspase酶活化參與凋亡有關，在此基礎上，作者還將進一步探索姜黃揮發油誘導黑色素瘤wm9細胞凋亡的具體信號通路，為探索黑色素瘤的新型藥物提供理論依據。

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Effect of turmeric volatile oil on proliferation and apoptosis of melanoma wm9 cells*

YeZhenyuan，TuYunhua，XueYuecui,RongDongyun，ZanXuejuan，PanJunling，CaoYu

(DepartmentofDermatology，AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang,Guizhou550004China)

ObjectiveTo investigate the effect of turmeric volatile oil on the proliferation and apoptosis of melanoma wm9 cells.MethodsDifferent concentration of turmeric volatile oil were applied on melanoma wm9 cells;Detection of proliferation inhibition rate by cell counting kit-8(CCK8);Morphological changes of cells were observed by inverted microscope；Caspase-3 activities were evaluated by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)；Cell cycle and apoptosis was analyzed with flow cytometry(FCM).ResultsThe effects of turmeric volatile on melanoma wm9 cells were different in different concentrations，when the drug concentration reached at 40 mg/L，typical apoptotic cells can be seen under the inverted microscope，Caspase-3 activities were positively correlated with drug concentration.Cell cycle of Wm9 cells were blocked in G2/M phase after exposed to turmeric volatile oil.ConclusionTurmeric volatile oil has capability of apoptois-inducing in Wm9 cells.Moreover,turmeric volatile oil activated the key enzyme of apoptosis pathway and arrested cell cycle in G2/M phase,which maybe the mechanism of turmeric volatile oil to inhibit proliferation and differentiation of tumor cells.

apoptosis;proliferation;turmeric volatile oil;wm9 cells

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.005

貴州省中藥現代化專項項目(黔科合中藥字[2012]5018號)。

葉振源(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事中草藥方面的研究。

R751

A

1671-8348(2016)25-3472-03

2016-03-11

2016-05-21)