抗腫瘤藥物誘導NK/T細胞淋巴瘤細胞株凋亡的研究*

趙文娜，吳　莉，王季石，李　杭，樊建民，李　勇

(1.貴州醫科大學研究生學院，貴陽 550004；2.貴州省人民醫院腫瘤科,貴陽 550002；3.貴州醫科大學附屬醫院血液科，貴陽 550004；4.山東省鄆城縣人民醫院血液科　274700)

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論著·基礎研究

抗腫瘤藥物誘導NK/T細胞淋巴瘤細胞株凋亡的研究*

趙文娜1，吳莉2△，王季石3，李杭2，樊建民4，李勇2

(1.貴州醫科大學研究生學院，貴陽 550004；2.貴州省人民醫院腫瘤科,貴陽 550002；3.貴州醫科大學附屬醫院血液科，貴陽 550004；4.山東省鄆城縣人民醫院血液科274700)

目的探討不同化療方案對NK/T細胞淋巴瘤細胞株(SNK6)的抑制率，并對其可能的相關機制進行研究。方法應用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細胞儀檢測、瓊脂糖凝膠電泳檢測等方法，研究不同化療藥物對SNK6細胞的誘導凋亡作用；蛋白印跡法檢測自噬蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表達，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果作用腫瘤細胞48 h的各藥物的抑制率與24 h所得的抑制率相比，差異有統計學意義(P<0.05)；作用72 h的各藥物抑制率與作用48 h相比，差異無統計學意義(P>0.05)。4組化療方案抑制率由高到低為：長春瑞濱+表柔比星、多西他賽+表柔比星、多西他賽+多柔比星、長春瑞濱+多柔比星；從實驗組細胞中提取的DNA經電泳，紫外燈下可見“梯狀帶”。進行蛋白印跡法及流式細胞儀檢測，抗腫瘤藥物聯合自噬抑制劑使自噬蛋白下調，細胞凋亡與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論長春瑞濱聯合表柔比星誘導SNK6細胞凋亡作用最佳，3-MA抑制SNK6細胞對化療藥物保護性自噬反應，增加SNK6細胞對抗腫瘤藥物細胞毒殺傷作用的敏感性。

凋亡；自噬；NK/T細胞淋巴瘤；3-甲基腺嘌呤

結外NK/T細胞淋巴瘤是WHO(2008年)對于淋巴和造血組織腫瘤分類中的一個獨立類型，屬于非霍奇金淋巴瘤的一種少見類型，占NHL的2%～10%。亞洲和南美洲發病率較高，約占總發病人數的70%，歐美發病約占21%[1]。

NK/T細胞淋巴瘤對傳統治療侵襲性NHL的CHOP方案不敏感，或短暫緩解后很快復發。國內外治療結外NK/T細胞淋巴瘤研究顯示，含左旋門冬酰胺酶(L-ASP) 的化療方案顯示出較好的療效，應用L-ASP治療CHOP方案無效及耐藥病例取得一定療效，完全緩解率約50%[2]。本研究擬采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同化療藥物及化療藥物組合方案對腫瘤細胞的抑制率，流式細胞儀檢測細胞凋亡，凝膠電泳檢測凋亡梯度，同時抑制自噬后研究自噬對抗腫瘤藥物誘導NK/T細胞淋巴瘤細胞凋亡作用，為NK/T細胞淋巴瘤臨床化療方案的選擇提供實驗室依據。

1　材料與方法

1.1材料NK/T細胞淋巴瘤細胞株(SNK6，常州貝源鑫生物科技有限公司)，MTT(美國invitrogen公司)，FACSVantage流式細胞儀 (美國BD公司)，數碼相機(美國BekmanCoulter公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，倒置相差生物顯微鏡 (日本Olympus公司)，酶標儀(美國 BIO-RAD 公司)，二氧化碳培養箱 (美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養取凍存細胞迅速放入37 ℃ 水浴箱中搖動使其快速融化，轉入已裝4 mL培養基的培養瓶中并放入含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養。當培養瓶中細胞匯合達到80%左右時，可傳代。

1.2.2實驗分組13個藥物組，每種藥物設0.50×終濃度、0.75×終濃度和1.00×終濃度3個處理組，檢測單藥處理細胞24、48、72 h的細胞抑制率。選單藥敏感的藥物組合2～3方案，各方案中藥物設0.25×終濃度、 0.50×終濃度、 1.00×終濃度3組，檢測化療藥物組合方案處理細胞的細胞抑制率、凋亡率和凋亡梯度。據所得敏感藥物組合方案，設空白對照組、長春瑞濱(10 mg/L)+表柔比星(1 mg/L)組、3-甲基腺嘌呤(3-MA 5 mmol/L)組和長春瑞濱(10 mg/L)+表柔比星(1 mg/L)+3-MA(5 mmol/L)組，檢測藥物組合方案處理的細胞凋亡率及自噬相關蛋白表達水平。

1.2.3細胞增殖抑制試驗取對數期SNK6細胞，稀釋至1×105個/mL，接種于96孔板中。所有藥物按說明書溶解成工作液。每種濃度的藥物設5個復孔，培養24～48 h后，每孔各加入50 μL MTT，于37 ℃恒溫培養箱中培養4 h。將96孔板1 000 r/min離心5 min，各加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振動5 min。自動酶標儀調零，檢測在5 790 nm處吸光度值(A值)。抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。同樣方法檢測化療藥物組合方案對SNK6細胞的抑制率。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡取對數生長期的SNK6細胞，調整細胞濃度為5×105/mL 接種于6孔板中培養，收集不同藥物組作用的細胞，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，離心棄上清液，分別加入FITc 標記的AnnexinV和PI，按試劑盒說明進行，流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度(激發波長488 nm，收集波長630 nm)，得出各組細胞的凋亡百分比。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡梯度收集不同藥物組作用24～48 h的細胞，進行裂解細胞，結合DNA，漂洗DNA，洗脫DNA等步驟提取DNA，溶于100 μL TE緩沖液中備用。制備凝膠板，加樣后置入電泳池，電泳30 min后取出凝膠板。紫外燈下觀察凝膠板。

1.2.6蛋白印跡法檢測自噬蛋白取對數生長期SNK6 細胞，分組加藥處理細胞24 h后進行后續操作。裂解細胞，提取4組細胞的蛋白，蛋白定量后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、抗體封閉、洗膜、孵育一抗和二抗，采用ECL．plus試劑盒曝光后顯影，后期經過數碼成像分析系統軟件對圖片進行掃描，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參照，應用image J軟件分析灰度值。計算各蛋白與β-actin的比值。實驗重復3次。

2　結　　果

2.113種化療藥物對NK/T細胞淋巴瘤細胞的體外抑制作用作用腫瘤細胞48 h所得的各藥物檢測抑制率中異環磷酰胺抑制率最低。與異環磷酰胺相比，同一濃度的長春瑞濱、表柔比星、多西他賽、多柔比星、阿糖胞苷、美羅華、吉西他濱、門冬酰胺差異有統計學意義(P<0.05)。作用腫瘤細胞48 h的各藥物的抑制率與24 h所得的抑制率相比，差異有統計學意義(P<0.05)；作用72 h的各藥物抑制率與作用48 h所得的抑制率相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

2.2組合方案

2.2.1組合方案的設計根據單藥體外試驗的敏感性及藥物對腫瘤細胞周期特異性，設計以下4種組合方案。A：長春瑞濱+表柔比星、B：長春瑞濱+多柔比星、C：多西他賽+表柔比星、D：多西他賽+多柔比星。在設定的單藥藥物濃度中，作用腫瘤細胞48 h抑制率最佳，故將4種組合方案的體外試抑制時間定為48 h。

2.2.24種組合方案的體外抑制作用見表2。

表1　　13種化療藥對NK/T細胞淋巴瘤細胞的體外抑制作用±s，%)

圖1　　單藥48 h達到中度敏感的藥物

藥物組合抑制率(x±s,%)0.25×終濃度0.50×終濃度1.00×終濃度A47.89±8.1356.54±8.6469.80±6.34B51.34±1.7656.81±2.6564.65±3.73C46.79±5.6154.11±5.9865.57±5.78D40.64±5.5153.67±5.8864.90±7.31

2.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡4組實驗的細胞凋亡率，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2　　各組SNK6細胞的凋亡率情況

2.2.4凝膠電泳檢測凋亡梯度本結果顯示4組細胞中提取的DNA經電泳后，可見特征性的“梯狀帶”，對照組DNA基因組條帶位于加樣孔附近。見圖3。

圖3　　凝膠電泳檢測凋亡梯度

2.3蛋白印跡法檢測自噬相關蛋白化療藥組的Beclin-1/β-actin比率值顯著高于空白對照組和化療藥+3-MA組(t=14.501、22.363，P<0.05)。化療藥組的LC3Ⅱ/β-actin比率值顯著高于空白對照組和化療藥+3-MA組(t=7.382、13.731，P<0.05)。見圖4～6。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡3-MA組、化療藥組的凋亡率分別為(6.57±2.52)%、(14.47±1.89)%顯著高于空白對照組(2.60±0.53)%(t=11.725、10.484，P<0.05)。化療藥組的凋亡率(14.47±1.89)%顯著低于化療藥+3-MA組(44.17±0.38)%(t=-26.719，P<0.05)。

圖4　　蛋白印跡法檢測自噬蛋白表達

圖5　　免疫印跡法檢測Beclin-1蛋白表達

圖6　　免疫印跡法檢測LC3Ⅱ蛋白表達

3　討　　論

NK/T細胞淋巴瘤是一種有特殊表現的結外NHL，好發于中青年，發病中位年齡在40歲左右。CHOP方案是治療侵襲性NHL的經典方案，但對NK/T細胞淋巴瘤的療效欠佳。文獻報道，單純CHOP樣方案化療后患者的完全緩解率一般低于40%，5年無失敗生存率為25%～40%,這可能與其高表達P-糖蛋白導致的多藥耐藥有關[3]。早期接受放療的患者具有較好的局部控制率和遠期生存率，但是聯合化療沒有提高整體療效。隨著放療技術的不斷進步，局限期NK/T細胞淋巴瘤治療失敗的主要原因已不再是局部復發，而多是腫瘤系統性播散導致的死亡。因此，化療起著不容替代的作用。臨床上惡性腫瘤的化療主要是根據循證醫學的研究結果或憑經驗采用較為固定的化療方案。據統計，常用的化療藥物抗腫瘤治療的有效性小于70%，20%～40%的腫瘤患者有可能接受了錯誤的化療藥物治療[4]。因此，預測腫瘤患者對化療藥物的敏感性，成為提高腫瘤患者化療療效、降低多藥耐藥性產生的必要前提。

本實驗在設定的單藥藥物體外藥敏試驗中，長春瑞濱、表柔比星、多西他賽、多柔比星達到中度敏感。其中長春瑞濱主要作用是與微管蛋白結合，使細胞在有絲分裂過程中微管形成障礙。長春瑞濱為周期特異藥物，作用近似長春新堿，濃度大于12 nmol時可阻斷G2-M期，除了對有絲分裂的微管以外，對軸突微管也有親和力。多柔比星、表柔比星屬于抗生素類抗腫瘤藥。為阿霉素的同分異構體，作用機制是直接嵌入DNA核堿對之間，干擾轉錄過程，阻止mRNA的形成，從而抑制DNA和RNA的合成。此外，表阿霉素對拓撲異構酶Ⅱ也有抑制作用。多柔比星、表柔比星為細胞周期非特異性藥物，與阿霉素相比療效相等或略高，但對心臟的毒性較小。多西他賽屬于周期特異藥物，為紫杉類化合物抗腫瘤藥，作用機制是加強微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，導致形成穩定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細胞有絲分裂。

有報道應用門冬酰胺酶治療CHOP方案無效及耐藥病例取得顯著療效，治療的完全緩解率約為50%。本實驗中在設定的單藥藥物濃度體外抑制試驗中，門冬酰胺酶作用腫瘤細胞24、48、72 h抑制率都未達到中度敏感。其中作用腫瘤細胞48 h的抑制率與作用腫瘤細胞24 h所得的抑制率相比，差異有統計學意義，說明化療對SNK6細胞抑制作用所時間延長而明顯增加；但作用72 h的抑制率與作用48 h所得的抑制率相比，差異無統計學意義，說明48～72 h門冬酰胺酶對SNK6細胞抑制作用隨時間延長不再增加。分析其原因，作者認為48～72 h細胞生長進入衰退期，96孔板培養基中營養物質消耗殆盡，代謝產物堆積，酸堿度改變，這些理化因素改變抑制細胞生長，促進細胞死亡；實驗組和對照組的細胞因非實驗因素大量死亡影響了MTT結果，致使本實驗中門冬酰胺酶作用腫瘤細胞抑制率未達到中度敏感，最終未能入選組合方案。

本檢測結果證明，在設定的單藥藥物濃度化療藥物誘導SNK6細胞凋亡體外試驗中，有4種藥物達到中度敏感：長春瑞濱、表柔比星、多西他賽、多柔比星。4種組合方案，抑制率、凋亡率由高到低依次為：長春瑞濱+表柔比星、多西他賽+表柔比星、多西他賽+多柔比星、長春瑞濱+多柔比星。從實驗組細胞中提取的DNA經電泳，紫外燈下可見特征性的“梯狀帶”，對照組DNA基因組條帶位于加樣孔附近，說明被檢測的細胞中有細胞凋亡的存在。4種組合方案的體外抑制率較相同條件下相對應的各個方案中單藥的抑制率均有不同程度增加，體現了藥物相互作用之中的協同作用。聯合用藥的目的是通過藥物聯合應用后產生有益的相互作用，包括增強藥物療效，減弱或減小用藥劑量等。

細胞自噬最早由Ashford和Porten于1962年用電子顯微鏡在人的肝細胞中發現，是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性降解途徑。近年研究表明，自噬過程受一系列復雜信號分子的調控，調控機制的失調與腫瘤的發生有重要的聯系[5]。Beclin-1復合物是自噬的主要調控平臺，其中包括Beclin-1、Bcl-2家族蛋白(能夠抑制自噬)、Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(VPS34)及ATG14L(自噬所需要的)E33[6]。臨床研究證實，自噬相關蛋白Beclin-1異常表達與進展期腫瘤惡性表型及預后不良存在關聯[7]。人類微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，LC3Ⅱ定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，常作為自噬的特異性標志物[8]。目前已經證明，自噬抑制劑3-MA 通過抑制Ⅲ型PI3K的活性抑制自噬形成。本結果證明，3-MA對SNK6細胞的自噬有明顯的抑制作用；長春瑞濱聯合表柔比星能引起細胞自噬，并且自噬可以有效地被3-MA抑制，進一步考慮自噬可能與化療藥物誘導細胞凋亡的作用機制有關。同時，自噬抑制劑3-MA可誘導部分SNK6細胞凋亡，3-MA聯合化療藥物誘導NK/T細胞淋巴瘤細胞凋亡作用明顯強于單用化療藥物。

綜上所述，化療藥物長春瑞濱、表柔比星、多西他賽、多柔比星對NK/T細胞淋巴瘤細胞有誘導凋亡的作用，其中長春瑞濱聯合表柔比星作用最佳，能增強細胞的自噬，抑制自噬有利于抗腫瘤藥物誘導NK/T細胞淋巴瘤細胞凋亡作用。

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The study of antitumor drugs to induce NK/T cell lymphoma cells apoptosis*

ZhaoWenna1,WuLi2△,WangJishi3,LiHang2,FanJianmin4,Liyong2

(1.GraduateSchoolofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang,Guizhou550004,China;2.DepartmentofOncology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;3.DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang,Guizhou550004,China;4.DepartmentofHematology,YunchengCountyPeople′sHospital,Heze,Shandong274700,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory rate of NK/T cell lymphoma cell line (SNK6) with different chemotherapy regimens,and to study its possible mechanism.MethodsMTT assay,flow cytometry detector,agarose gel electrophoresis detection method were used to study the effect of different chemotherapeutic agents on the apoptosis of SNK6 cell line;the expression of autophagy protein Beclin-1 and LC3Ⅱ was detected by Western blot assay,and apoptosis was detected by flow cytometry.ResultsThe inhibition rate of 48 h of the tumor cells was significantly different from that of 24 h, and the difference was statistically significant(P<0.05),there was no significant difference in the inhibitory rate between72 h and 48 h(P>0.05).The chemotherapy inhibition rate in 4 groups of from high to low:Changchun vinorelbine+epirubicin,docetaxel+epirubicin,docetaxel+doxorubicin, Changchun vinorelbine+doxorubicin.The DNA extracted from the cells of the experimental group was treated by electrophoresis, and the ladder band was visible under the UV lamp.Western blot and flow cytometry showed that the anti tumor drugs combined with autophagy inhibitors reduced autophagy, apoptosis compared with the control group, the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionSNK6 cell lines induced apoptosis in vitro experiment,vinorelbine,epirubicin,docetaxel and doxorubicin achieve moderate sensitivity.Combination of vinorelbine and epirubicin has the best effect that induce SNK6 cells apoptosis.3-MA inhibited autophagy protective response to chemotherapy drugs of SNK6 cell,then increase SNK6 cell′s sensitivity that antitumor drugs damage effect.

apoptosis;autophagy;NK/T cell lymphoma;3-methyladenine.

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.007

貴陽市科技計劃項目(筑科合同[20151001]社56號)。

趙文娜(1991-)，在讀碩士，主要從事血液、淋巴系統疾病研究。

，E-mail:wulishengyi@163.com。

R551.2

A

1671-8348(2016)25-2478-04

2016-03-26

2016-05-18)