響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取芹菜中黃酮的工藝研究

黃菊，何偉平

（1.徐州工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221111；2.徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221140）

響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取芹菜中黃酮的工藝研究

黃菊1，何偉平2

（1.徐州工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221111；2.徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221140）

以乙醇為提取溶劑，采用單因素和響應(yīng)面分析法相結(jié)合的手段優(yōu)選芹菜中黃酮提取工藝。首先通過(guò)單因素試驗(yàn)初步探討了液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)主要因素對(duì)黃酮得率的影響規(guī)律。然后，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立了回歸方程的預(yù)測(cè)模型，方差和響應(yīng)面分析結(jié)果表明：4個(gè)因素及其二次項(xiàng)對(duì)黃酮提取率影響顯著，料液比和提取溫度、料液比和提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度之間的交互作用顯著。最終，確定了芹菜黃酮提取的最佳工藝條件為液料比41∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)84%，提取溫度83℃，提取時(shí)間134 min，在此條件下黃酮提取率為3.276%。

芹菜；黃酮；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

芹菜（Apium graveolens L.）種屬為傘形花科類，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富作為餐桌的佳肴，且研究證實(shí)其中含有多種黃酮類化合物，在醫(yī)學(xué)上對(duì)高血壓的治療起到很大的幫助作用。由于作為食材時(shí)主要選用芹菜的嫩莖葉，其他部分則浪費(fèi)較多，大量上市時(shí)價(jià)格低廉也影響菜農(nóng)收益，因此，加強(qiáng)芹菜副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用具有一定的保健價(jià)值和實(shí)際意義。

關(guān)于芹菜黃酮的研究已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，如王克勤[1-3]等對(duì)湖南地區(qū)芹菜的不同品種以及不同部位的黃酮提取量進(jìn)行了系統(tǒng)研究，采用正交法優(yōu)化提取工藝，并提取物進(jìn)行了定量分析；趙云玲[4]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了芹菜黃酮的提取工藝，Baiano[5]等研究了微波輔助和傳統(tǒng)方法提取蔬菜固體廢物中抗氧化劑工藝變量的單一和交互影響過(guò)程，Profir[6]等研究了甜菜根、胡蘿卜和芹菜混合汁經(jīng)冷藏后的抗氧化性演變規(guī)律，可見(jiàn)對(duì)芹菜中黃酮類化合物的研究主要集中在黃酮含量的分析、抗氧化能力和藥理學(xué)功能等方面，對(duì)芹菜黃酮提取工藝多采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)化，而采用響應(yīng)面優(yōu)化芹菜黃酮的研究報(bào)道相對(duì)較少。

本文在借鑒現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上，對(duì)徐州當(dāng)?shù)氐那鄄巳~中黃酮化合物進(jìn)行乙醇提取試驗(yàn)，并采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取液中黃酮含量，為促進(jìn)徐州本地芹菜的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（含配套1 cm比色皿）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH.S21-4-B型電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA1004電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：山東荷澤市祥龍電子科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和樣品

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：Aladdin Industrial Corporation；無(wú)水乙醇（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（AR）：中國(guó)徐州試劑總廠；氫氧化鈉（AR）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硝酸鋁（AR）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；芹菜：購(gòu)于徐州當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 黃酮的提取與含量測(cè)定

本研究采用乙醇加熱浸提法作為芹菜中黃酮提取的基本工藝，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取液中黃酮類化合物含量。試驗(yàn)時(shí)先將芹菜清洗干凈，晾干粉碎，置于烘箱中，65℃干燥約8 h至烘干，研成粉末，過(guò)50目篩，放于廣口瓶中備用。準(zhǔn)確稱取2.00 g芹菜粉末置于三口燒瓶中，控制一定溫度，加入乙醇溶液進(jìn)行提取，一定時(shí)間后趁熱抽濾，將提取液用無(wú)水乙醇定容至100 mL容量瓶中，待測(cè)。測(cè)定時(shí)移取溶液2 mL于25 mL容量瓶中，滴加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，然后滴加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，定容至刻度，搖勻靜置15 min后，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

提取液中黃酮含量以蘆丁計(jì)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。首先精密稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL容量瓶中配制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后分別移取 0、2.5、5、7.5、10、12.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，4%氫氧化鈉溶液10 mL，用乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min。配制成 0.00、.0.02、0.04 、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度值（A）對(duì)濃度（c）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)最小二乘法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝7.775 0c+0.017 6，R2＝0.994 5。說(shuō)明在 0～0.1 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度和蘆丁濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選擇液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）對(duì)黃酮化合物提取率影響較大的4個(gè)因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定各因素適宜的水平。

1.2.4 黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以黃酮提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of box-benhnken design test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g干芹菜粉末，使用60%乙醇分別以 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）的液料比在80℃的溫度下提取，120 min之后進(jìn)行過(guò)濾，測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算黃酮的得率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of ratio of liguid to material on yield of flavonoids

在有機(jī)溶劑的提取試驗(yàn)中，本試驗(yàn)中首先要選擇合適的液料比，這樣有助于原料之間充分完全反映又不會(huì)影響產(chǎn)物的生成，達(dá)到預(yù)期的得率。在該試驗(yàn)中，溶劑的量越大，越有助于黃酮類化合物的溶解，使反應(yīng)正向性增強(qiáng)。圖1的曲線反映的是黃酮提取率隨液料比升高的變化趨勢(shì)。液料比從20∶1（mL/g）變化到40 ∶1（mL/g），提取率也越來(lái)越高，30 ∶1（mL/g）到 35∶1（mL/g）之間液料比增加，提取率提升的最為迅速。液料比超過(guò)40∶1（mL/g），提取率反而略有下降，這說(shuō)明這時(shí)加入溶劑不但對(duì)提取率的提高沒(méi)有幫助，也造成了資源的浪費(fèi)。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g干芹菜粉末，分別用40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇在80℃的溫度下以液料比為 40 ∶1（mL/g）提取 120 min，測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度來(lái)計(jì)算黃酮的得率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on yield of flavonoids

2.1.3 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g干芹菜粉末，用70%乙醇分別在40、50、60、70、80、90 ℃下，以液料比為 40 ∶1（mL/g）提取120 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮得率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3表明，從整體上看，溫度升高，黃酮的提取率也越來(lái)越高；但溫度從80℃升高到90℃時(shí)，提取率反而出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。可能是因?yàn)殚_(kāi)始的時(shí)候升高溫度，會(huì)使物質(zhì)進(jìn)一步溶解，分子運(yùn)動(dòng)劇烈程度增加，更利于滲透的進(jìn)行。因此芹菜中黃酮提取率整體呈上升趨勢(shì)。但隨著溫度再升高，過(guò)高的溫度反而會(huì)破壞黃酮類化合物的活性分子。因此從試驗(yàn)得出在80℃是黃酮提取的最佳溫度。

圖3 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on yield of flavonoids

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確取2.00 g干芹菜粉末，溫度設(shè)置為70℃，控制液料比為40∶1（mL/g），在70%的乙醇下回流提取30、60、90、120、150、180 min 后，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮得率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time on yield of flavonoids

可以用擴(kuò)散、滲透和溶解來(lái)描述芹菜黃酮類化合物的提取。通常，提取的充分度與提取時(shí)間成正比，但是，當(dāng)反應(yīng)中的反應(yīng)物之間達(dá)到了一種平衡了，再加入物質(zhì)來(lái)破壞其平衡，不利于最后的得率，雜質(zhì)也將變多。此外，長(zhǎng)時(shí)間處于高溫條件下芹菜黃酮類物質(zhì)不穩(wěn)定，會(huì)氧化分解，反而使得得率有所下降。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，黃酮已經(jīng)很好的被提取出來(lái)。再增加時(shí)間，反而會(huì)使這種平衡會(huì)打破，黃酮類物質(zhì)反含量反而降低。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)還可能使黃酮的內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到破壞，得率會(huì)因此而下降。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

隨著我國(guó)教育體制改革在中學(xué)階段地不斷深入，學(xué)校越來(lái)越重視學(xué)生的全面發(fā)展，且學(xué)校的綜合發(fā)展呈現(xiàn)出了較好趨勢(shì)，然而，其中以中學(xué)財(cái)務(wù)工作中預(yù)算管理問(wèn)題為主，主要表現(xiàn)在預(yù)算編制不夠科學(xué)，預(yù)算執(zhí)行力緩慢且隨意，以及缺乏完善的預(yù)算評(píng)價(jià)系統(tǒng)上，因此，此次課題對(duì)中學(xué)財(cái)務(wù)工作中遇到的預(yù)算管理問(wèn)題展開(kāi)了研究，對(duì)預(yù)算管理全新理念的豐富具有理論性意義，對(duì)中學(xué)財(cái)務(wù)實(shí)踐工作的進(jìn)展具有實(shí)際意義。

根據(jù)響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以芹菜中黃酮提取率為響應(yīng)值，取液料比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and the response values

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到芹菜中黃酮提取率對(duì)所選四個(gè)因素（即液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

芹菜黃酮提取率/%=3.12+0.096×A+0.48×B+0.24×C+0.17×D+0.042×A×B+0.16×A×C-0.15×A×D+0.16×B×C+0.10×B×D+0.068×C×D-0.67×A2-0.64×B2-0.52×C2-0.47×D2

對(duì)所得模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示；回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3 多元回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the response surface quadratic model

由表3可以看出，F(xiàn)檢驗(yàn)顯示該模型有較高的F值（67.93）和極低的 P值（<0.000 1），可知該回歸方程模型極顯著；失擬項(xiàng)的P=0.056>0.05，失擬不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2和調(diào)整確定系數(shù)R2Adj分別0.985 5和0.971 0，說(shuō)明97.1%響應(yīng)值的變化是由獨(dú)立變量決定。此外，失擬項(xiàng)的F=5.58，P=0.056，相對(duì)于純誤差不顯著，即該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較好，預(yù)測(cè)殘差平方和為0.15，說(shuō)明此模型解釋變差的能力較強(qiáng)，總體擬合具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以用來(lái)預(yù)測(cè)芹菜中黃酮提取工藝。

亦由表3方差分析結(jié)果知，模型的一次項(xiàng)A的P=0.0057在0.05水平顯著，B、C和D的P均小于0.0001，則極顯著；二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2的 P 均小于 0.000 1，則二次項(xiàng)均極顯著；交互項(xiàng)AC、AD、BC在0.05水平顯著，AB，BD，CD不顯著。由此可以得到不同的提取條件與黃酮提取率之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。另外，根據(jù) F 值，A=10.65，B=262.75，C=66.31，D=33.35，很容易得各單個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響順序：B>C>D>A，即乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間>液料比。

2.2.3 響應(yīng)曲面圖和等高線圖分析

利用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并生成響應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖5所示。

圖5 響應(yīng)曲面圖和各因素交互影響的等高線圖Fig.5 Response surfaces and contours plots for flavonoids extracted from Celery

響應(yīng)曲面圖和等高線可以直觀地展示各個(gè)變量試驗(yàn)值與響應(yīng)值黃酮得率之間的關(guān)系，以及兩個(gè)被測(cè)變量間交互作用的強(qiáng)弱，響應(yīng)曲面坡度陡峭程度越明顯，則響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)條件的改變也越敏感。等高線圖的形狀可以清晰地反映兩兩被測(cè)變量交互影響作用的顯著與否，橢圓形的等高線表示兩兩因素交互作用顯著，反之等高線越圓則表明兩兩因素交互作用越不顯著。從圖5中可以看出，AC、AD和BC交互作用較顯著，其余不顯著。

2.3 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證

根據(jù)Design-Expert軟件的計(jì)算結(jié)果可得芹菜中黃酮提取的最佳工藝參數(shù)和理論提取率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化Table 4 The optimization of extration process

考慮到實(shí)際試驗(yàn)條件的關(guān)系，選擇料液比41∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)84%、提取溫度83℃和提取時(shí)間134 min進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和重復(fù)性考察，得到芹菜黃酮的平均得率為3.276%（n=3），RSD=1.53%，稍低于理論得率，但在誤差范圍內(nèi)，認(rèn)為該工藝條件的優(yōu)化結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確率。

3 結(jié)論

本研究選擇液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)對(duì)芹菜黃酮提取率影響較大的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果建立了相應(yīng)的二次回歸方程。方差分析和響應(yīng)面分析結(jié)果表明4個(gè)因素及其二次項(xiàng)對(duì)黃酮提取率影響顯著，料液比和提取溫度、料液比和提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度之間的交互作用顯著。

通過(guò)相應(yīng)面分析確定芹菜中黃酮提取的最佳的工藝條件為：液料比41∶1（mL/g），乙醇濃度84%，提取溫度83℃，提取時(shí)間134 min，此時(shí)黃酮的提取率為3.276%（n＝3），RSD＝1.53%，略低于理論數(shù)據(jù) 3.293%，表明該方法可用于芹菜黃酮提取工藝的分析和預(yù)測(cè)，具有一定的可靠性。

[1] 王克勤,陳靜萍,羅軍武,等.芹菜葉黃酮提取工藝條件優(yōu)化研究[J].食品與機(jī)械,2007,23(4)：95-97

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[5] Baiano Antonietta,Bevilacqua Luisa,Terracone Carmela,et al.Single and interactive effects of process variables on microwave-assisted and conventional extractions of antioxidants from vegetable solid wastes[J].Journal of Food Engineering,2014,120(1)：135-145

[6] ProfirAlina G,VizireanuCamelia.Evolution of antioxidant capacity of blend juice made from beetroot,carrot andcelery during refrigerated storage[J].Annals of the University Dunarea de Jos of Galati,Fascicle VI：Food Technology,2013,37(2)：93-99

Optimization of Ethanol Extraction of Flavonoids from Celery by Response Surface Methodology

HUANG Ju1，HE Wei-ping2
（1.School of Chemistry&Chemical Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，Jiangsu，China；2.School of Chemical Engineering，Xuzhou College of Industrial Technology，Xuzhou 221140，Jiangsu，China）

The optimal extraction process of flavonoids from celery were investigated using ethanol as solvent by single factor experiment and response surface methodology.The effects of liquid-solid ratio，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time on the flavonoids yield were discussed.Further，the predictive model of regression equation was established by Box-Behnken design.The results of Anova and response surface analysis indicate that，the flavonoids yield was significantly influenced by the 4 factors and their quadratic term.And the interactions were prominent among liquid-solid ratio，extraction temperature and extraction time，ethanol concentration and extraction temperature.Ultimately，the optimum extraction conditions were obtained as follows：liquid-solid ratio 41 ∶1 （mL/g），ethanol concentration 84%，extraction temperature 83 ℃ and extraction time 134 min.Under these conditions，the extraction rate is 3.276%.

celery；flavonoids；response surface methodology；process optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.013

徐州工程學(xué)院校級(jí)科研課題（XKY2013316）

黃菊（1985—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然藥物有效成分的提取。

2015-07-19