泛素連接酶Cbl?b在黑素瘤組織和細胞系A375、M14、MV3中的表達及意義

王小坡 溫斯健 粟倩雅 宋昊 倪娜娜 姜祎群 陳浩 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（王小坡、溫斯健、宋昊、倪娜娜、姜祎群、陳浩、孫建方），激光科（粟倩雅），江蘇省皮膚病性病分子生物學重點實驗室（倪娜娜）

泛素連接酶Cbl?b在黑素瘤組織和細胞系A375、M14、MV3中的表達及意義

王小坡 溫斯健 粟倩雅 宋昊 倪娜娜 姜祎群 陳浩 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（王小坡、溫斯健、宋昊、倪娜娜、姜祎群、陳浩、孫建方），激光科（粟倩雅），江蘇省皮膚病性病分子生物學重點實驗室（倪娜娜）

目的探討泛素連接酶Cbl?b在皮膚黑素瘤組織及黑素瘤細胞系A375、M14、MV3中的表達及意義。方法收集69份黑素瘤、30份色素痣組織，采用免疫組化法檢測Cbl?b蛋白表達水平。實時熒光定量PCR、免疫印跡法分別檢測黑素瘤細胞系A375、M14、MV3及黑素細胞中Cbl?b mRNA及蛋白表達水平。結果69份皮膚黑素瘤標本中，52份（75.36%）表達Cbl?b；30份色素痣標本中，4份（13.33%）表達Cbl?b，兩組Cbl?b蛋白表達水平差異有統計學意義（χ2=32.745，P＜0.01）。黑素瘤組織中Cbl?b表達水平與腫瘤進展程度、Clark分級和Breslow厚度均呈正相關（rs分別為0.569、0.654、0.727，均P＜ 0.01）。實時熒光定量PCR顯示，A375、M14、MV3細胞Cbl?b mRNA表達差異有統計學意義（F=176.537，P＜ 0.01）。免疫印跡法顯示，A375細胞Cbl?b蛋白表達水平最高，黑素細胞最低。結論Cbl?b蛋白在皮膚黑素瘤組織及其細胞株中均高表達。

泛素蛋白連接酶類；黑色素瘤；黑素細胞；腫瘤侵潤；腫瘤分級；Cbl?b

皮膚惡性黑素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）起源于黑素細胞，具有高度侵襲及致死率。盡管原位黑素瘤通過早期手術切除可完全治愈，但轉移性黑素瘤預后差，平均生存時間僅6～8個月［1］。隨著黑素瘤分子生物學機制的研究進展，分子靶向治療對提高黑素瘤無進展期生存提供了希望［2］。Cbl（casitas B?lineage lymphoma）?b 屬于泛素連接酶Cbl家族。研究表明，Cbl?b可作為泛素連接酶或連接蛋白調控各種細胞內信號轉導，參與腫瘤發病過程，因此可作為分子靶向治療的有效靶點之一［3?5］。未探討Cbl?b是否參與CMM發生發展過程，我們采用免疫組化檢測Cbl?b在黑素瘤組織及色素痣中表達，并分析Cbl?b表達與黑素瘤臨床病理特征相關性。同時利用實時熒光定量PCR和免疫印跡檢測黑素瘤細胞系及正常黑素細胞中Cbl?b表達。

材料與方法

一、標本來源

CMM和色素痣石蠟標本均來自2014年1月至2015年12月在中國醫學科學院皮膚病醫院病理科，其中CMM 69例，色素痣30例，所有標本均經臨床、組織病理或免疫病理證實診斷。69例CMM中肢端CMM 55例，非肢端CMM 14例；男34例，女35例。發病年齡26～89歲，平均年齡62歲。根據文獻［6］分類，原位CMM 28例，侵襲CMM 37例，轉移CMM 4例，3例淋巴結轉移，1例皮膚轉移。

二、主要試劑及細胞系

鼠抗人單克隆Cbl?b抗體（美國Santa Cruz生物技術公司），二氨基聯苯胺（DAB）酶底物顯色試劑盒和即用型快捷免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術公司），DMEM培養基（美國Gibco公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），逆轉錄PCR（RT?PCR）試劑盒（美國Promega公司），30%過氧化氫溶液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，實時熒光定量PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。A375黑素瘤細胞系（美國ATCC公司）來自1例54歲惡性黑素瘤女性。M14黑素瘤細胞系（江蘇凱基生物技術股份有限公司），來自1例33歲男性轉移至臀部的無色素黑素瘤。MV3人類黑素瘤細胞系（江蘇凱基生物技術股份有限公司）來源于淋巴結轉移性黑素瘤。以上3株黑素瘤細胞系均由中國醫學科學院皮膚病研究所中心試驗室長期保存，使用時復蘇、培養。正常黑素細胞分離自1例11歲男孩包皮，傳代3次后用于后續試驗（本所研究生粟倩雅惠贈）。

三、方法

1.免疫組化檢測石蠟組織切片中Cbl?b蛋白表達：石蠟切片常規脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中高壓抗原修復，自然冷卻后水洗，之后將切片置于含10%過氧化氫溶液塑料盒中，60℃恒溫水浴脫色素，時間40～60 min，脫色素完成后以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，后續步驟同常規SP法［7］。免疫組化結果判定：以胞質和（或）胞膜出現棕褐色顆粒為Cbl?b陽性。讀片者在不清楚臨床信息的情況下，于400倍視野下隨機選取5個不同視野，按腫瘤細胞陽性率及染色強度分別計算得分。染色強度判定標準：不著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞率：無陽性細胞為0分，陽性細胞＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為4分。兩項積分相乘為該視野得分，5個視野的平均得分為最后得分。按得分劃分等級：0～1分為（-），2～3分為（+），4 ～ 6分為（++），＞ 6分為（+++）［8］。結果判定由我科兩位皮膚病理醫師獨立進行。

2.實時熒光定量PCR檢測Cbl?b mRNA相對表達：用Trizol試劑分別提取A375、M14、MV3細胞系和黑素細胞總RNA，測定總RNA質量和濃度，A260/A280在1.9～ 2.1之間為合格，各樣本取1 μg RNA按說明書將其反轉錄為cDNA。引物設計和合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。Cbl?b：上游引物：5′?GATGAATCGGTTGGCAAAC?3′，下游引物：5′?GGGTGGCAGGCTTAGATG?3′，目的產物139 bp。3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）：上游引物：5′?AAATCCCATCACCATCTTCC?3′，下游引物：5′?ATGACCCTTTTGGCTCCC?3′，目的產物 147 bp。PCR擴增目的基因片段，擴增條件：95℃預變性10 min；95 ℃變性10 s；60℃退火/延伸30 s，收集熒光，共40個循環。所有試驗重復3次。以2?△△Ct值表示Cbl?b mRNA相對表達量。

3.免疫印跡法檢測Cbl?b蛋白表達：離心收集黑素細胞和上述3株黑素瘤細胞系細胞，按常規蛋白樣品制備方法提取蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）方法測定蛋白濃度。將樣品用裂解緩沖液稀釋至相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為50 μg，并于95～100℃條件下變性5 min后冷卻上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓80 V約30 min，分離膠100 V約90 min。電泳后將凝膠中蛋白通過濕電轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。用含5%脫脂奶粉的封閉液4℃封閉PVDF膜過夜，按約0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量一抗（Cbl?b單克隆抗體工作濃度為1∶500，β肌動蛋白作為內參照），4℃搖床振蕩孵育過夜。PBS漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫振蕩孵育2 h。顯影，曝光，成像。用Image J分析軟件對條帶灰度進行分析。

4.統計學方法：采用SPSS23.0系統分析軟件。計數資料比較采用卡方檢驗，兩組等級資料比較采用Mann?WhitneyU檢驗；Cbl?b和腫瘤進展、分級相關性分析采用Spearman相關檢驗。多組間計量資料采用方差分析，方差不齊時采用非參數檢驗（Kruskal?Wallis檢驗）。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、黑素瘤組織Cbl?b蛋白表達與臨床特征及腫瘤侵襲和轉移的關系

69份黑素瘤組織切片中，52份（75.36%）表達Cbl?b；30份色素痣組織切片中，4份（13.33%）表達Cbl?b（圖1），兩組表達率差異有統計學意義（χ2=32.745，P＜ 0.01）。而且，黑素瘤有潰瘍組Cbl?b表達水平明顯高于無潰瘍組（U=148.00，P＜0.01），但不同性別組間、有/無炎癥細胞浸潤組間Cbl?b表達差異均無統計學意義（U=507.00，470.50，均P＞0.05）。Cbl?b 表達水平與腫瘤進展、Clark分級和Breslow 厚度均呈正相關（rs分別為 0.569、0.654、0.727，均P＜ 0.01）。見表1。

二、黑素細胞及A375、M14、MV3細胞系Cbl?b mRNA相對表達水平

黑素細胞及A375、M14和MV3細胞內 Cbl?b mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、0.72±0.06、0.20±0.02、0.58±0.06，各組mRNA表達差異有統計學意義（F=176.537，P＜0.01），以黑素細胞表達量最高，其次為A375、MV3，M14表達量最低。

三、黑素細胞及A375、M14、MV3細胞系 Cbl?b蛋白表達水平

A375細胞Cbl?b蛋白表達水平最高，依次為M14、MV3，黑素細胞中表達最低（圖2）。

圖1 免疫組化結果（SP×100） 1A：淺表播散性原位黑素瘤組織中Cbl?b胞質陽性表達；1B：侵襲性黑素瘤組織中Cbl?b胞質陽性表達；1C：淋巴結轉移性黑素瘤組織中Cbl?b胞質陽性表達；1D：皮內痣中Cbl?b陰性表達

表1 皮膚黑素瘤組織中Cbl?b蛋白表達與黑素瘤患者臨床特征的關系

討 論

Cbl?b屬于環指（RING）型泛素連接酶E3，由位于3q13.11的CBLB基因編碼。Cbl?b通過N?端酪氨酸激酶結合（tyrosine kinase binding，TKB）結構域識別并結合底物蛋白酪氨酸激酶，RING結構域募集泛素結合酶E2，從而啟動底物泛素化降解，參與細胞內信號轉導的負向調控［9］。然而Cbl?b蛋白也可作為連接蛋白招募信號分子至蛋白酪氨酸激酶，從而激活Ras?MAPK、PI3K/AKT等一系列下游信號通路分子，發揮促進細胞有絲分裂、分化、抗凋亡和促轉移等作用［10?12］。

圖2 免疫印跡法檢測Cbl?b蛋白在黑素細胞（MC）及A375、M14、MV3細胞系中的表達

我們通過免疫組化發現，黑素瘤組織中Cbl?b表達陽性率明顯高于色素痣。而且，Cbl?b在伴有潰瘍的CMM中表達水平明顯高于無潰瘍的CMM，其表達水平與影響預后因素（Clark分級、Breslow厚度）正相關，隨腫瘤的侵襲和轉移而升高。因此我們推測，Cbl?b在黑素瘤中可能作為連接蛋白激活Ras?MAPK、PI3K/AKT等一系列下游信號通路，從而促進黑素瘤侵襲和轉移，但不能完全否認Cbl?b在黑素瘤組織中高表達是腫瘤發生發展中的一種伴隨現象。Fan等［13］研究表明，Cbl?b可使抑癌蛋白富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）泛素化降解，從而引起腫瘤細胞解離，促進腫瘤轉移。因此，不排除Cbl?b通過降解有關抑癌蛋白從而促進黑素瘤發生發展的可能。

本研究中實時熒光定量PCR結果顯示，黑素細胞和黑素瘤細胞系Cbl?b mRNA表達水平差異有統計學意義，以黑素細胞表達量最高，其次為A375、MV3，M14表達量最低。免疫印跡結果顯示，3株黑素瘤細胞系Cbl?b蛋白表達水平均高于黑素細胞，以A375細胞表達水平最高。在黑素細胞和黑素瘤細胞系中，Cbl?b mRNA和蛋白表達水平不一致，這可能與黑素細胞和黑素瘤細胞中Cbl?b基因轉錄后存在不同的轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工及修飾（如microRNA調節、泛素化、蛋白穩定性）等有關［14］。本研究發現，黑素瘤組織中Cbl?b表達高于色素痣，黑素瘤細胞株Cbl?b蛋白表達高于黑素細胞，組織水平與細胞水平Cbl?b蛋白表達結果一致。

本研究結果顯示，Cbl?b在黑素瘤組織中的表達明顯高于良性色素痣，并且黑素瘤細胞株中Cbl?b蛋白的表達也高于黑素細胞。但Cbl?b是否影響黑素瘤細胞株的生物學行為及相關分子機制尚需更深入的研究。綜上所述，我們認為Cbl?b可能是靶向藥物的篩選靶點之一以及判斷黑素瘤惡性程度、侵襲性的指標之一。

［1］Cummins DL,Cummins JM,Pantle H,et al.Cutaneous malignant melanoma［J］.Mayo Clin Proc,2006,81（4）:500 ?507.DOI:10.4065/81.4.500.

［2］Vennepureddy A,Thumallapally N,Motilal NV,et al.Novel drugs and combination therapies for the treatment of metastatic melanoma［J］.J Clin Med Res,2016,8（2）:63 ?75.DOI:10.14740/jocmr2424w.

［3］Paolino M,Choidas A,Wallner S,et al.The E3 ligase Cbl?b and TAM receptors regulate cancer metastasis via natural killer cells［J］.Nature,2014,507（7493）:508 ?512.DOI:10.1038/nature12998.

［4］Li H,Xu L,Li C,et al.Ubiquitin ligase Cbl?b represses IGF?I?induced epithelialmesenchymaltransition via ZEB2 and microRNA ?200c regulation in gastric cancer cells［J］.Mol Cancer,2014,13:136.DOI:10.1186/1476?4598?13?136.

［5］Tsygankov AY,Teckchandani AM,Feshchenko EA,et al.Beyond the RING:CBL proteins as multivalent adapters［J］.Oncogene,2001,20（44）:6382?6402.DOI:10.1038/sj.onc.1204781.

［6］Balch CM,Gershenwald JE,Soong SJ,et al.Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification［J］.J Clin Oncol,2009,27（36）:6199?6206.DOI:10.1200/JCO.2009.23.4799.

［7］Liu CH,Lin CH,Tsai MJ,et al.Melanin bleaching with dilute hydrogen peroxide:a simple and rapid method［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol,2013,21（3）:275 ?279.DOI:10.1097/PAI.0b013e31826d81db.

［8］Bosman FT,de Goeij AF,Rousch M.Quality control in immuno?cytochemistry:experiences with the oestrogen receptor assay［J］.J Clin Pathol,1992,45（2）:120?124.DOI:10.1136/jcp.45.2.120.

［9］Liyasova MS,Ma K,Lipkowitz S.Molecular pathways:cbl proteins in tumorigenesis and antitumor immunity?opportunities for cancer treatment［J］.Clin Cancer Res,2015,21（8）:1789 ?1794.DOI:10.1158/1078?0432.CCR?13?2490.

［10］Arron JR,Vologodskaia M,Wong BR,et al.A positive regulatory role for Cbl family proteins in tumor necrosis factor?related activation?induced cytokine（trance）and CD40L?mediated Akt activation［J］.J Biol Chem,2001,276（32）:30011?30017.DOI:10.1074/jbc.M100414200.

［11］Yasuda T,Tezuka T,Maeda A,et al.Cbl?b positively regulates Btk?mediated activation of phospholipase C?gamma2 in B cells［J］.J Exp Med,2002,196（1）:51?63.DOI:10.1084/jem.20020068.

［12］Liu J,DeYoung SM,Hwang JB,et al.The roles of Cbl?b and c?Cbl in insulin ?stimulated glucose transport［J］.J Biol Chem,2003,278（38）:36754?36762.DOI:10.1074/jbc.M300664200.

［13］Fan Y,Qu X,Ma Y,et al.Cbl?b accelerates trypsin?induced cell detachment through ubiquitination and degradation of proline?rich tyrosine kinase 2［J］.Tumour Biol,2014,35（11）:11129 ?11135.DOI:10.1007/s13277?014?2296?z.

［14］de Sousa Abreu R,Penalva LO,Marcotte EM,et al.Global signatures of protein and mRNA expression levels［J］.Mol Biosyst,2009,5（12）:1512?1526.DOI:10.1039/b908315d.

Casitas B?lineage lymphoma b in malignant melanoma tissues and cell lines A375,M14 and MV3:expression and clinical significance

Wang Xiaopo,Wen Sijian,Su Qianya,Song Hao,Ni Nana,Jiang Yiqun,Chen Hao,Sun Jianfang
Department of Pathology，Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wang XP,Wen SJ,Song H,Jiang YQ,Chen H,Sun JF）；Department of Cosmetic Laser Surgery（Su QY）;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China（Ni NN）
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo measure the expression of casitas B?lineage lymphoma b（Cbl?b）in cutaneous malignant melanoma（CMM）tissues and cell lines A375,M14 and MV3,and to assess its clinical significance.MethodsImmunohistochemistry was carried out to measure Cbl?b expression in paraffin?embedded tissue sections from 69 cases of CMM and 30 cases of pigmented nevus.Real?time fluorescence?based quantitative PCR and Western?blot analysis were performed to determine the mRNA and protein expressions of Cbl?b in melanocytes and the three cell lines respectively.ResultsThe positive rate of Cbl?b was significantly higher in CMM tissues than in pigmented nevus tissues（75.36%［52/69］vs.13.33%［4/30］,χ2=32.745,P＜ 0.01）.The expression level of Cbl?b in CMM tissues was positively correlated with the stage of tumor progression,Clark′s level and Breslow thickness of CMM（rs=0.569,0.654,0.727,respectively,allP＜ 0.01）.As fluorescence?based quantitative PCR showed,there were significant differences in the mRNA expression of Cbl?b among A375,M14 and MV3 cells（F=176.537,P＜ 0.01）.Western?blot analysis revealed the protein expression of Cbl?b in the 3 melanoma cell lines and melanocytes,which was highest in A375 cells,and lowest in melanocytes.ConclusionCbl?b was overexpressed in CMM tissues and cell lines.

Ubiquitin?proteinligases;Melanoma;Melanocytes;Neoplasminvasiveness;Neoplasmgrading;Cbl?b

孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.12.007

國家自然科學基金（81272992）；江蘇省自然科學基金（BK20131063）；北京協和醫學院研究生創新基金（2015?1002?01?12）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province（BK20131063）;Graduate Innovation Fund of Peking Union Medical College（2015?1002?01?12）

2016?03?14）

（本文編輯：尚淑賢）