阿維A與干擾素對人皮膚T細胞淋巴瘤細胞株Hut78細胞增殖及白細胞介素15表達的影響

于凱王一宇 金仙花 李雪 朱文靜 夏建新

252000山東，聊城市人民醫院皮膚科（于凱）；吉林大學第二醫院皮膚科（王一宇、金仙花、李雪、朱文靜、夏建新）

阿維A與干擾素對人皮膚T細胞淋巴瘤細胞株Hut78細胞增殖及白細胞介素15表達的影響

于凱王一宇 金仙花 李雪 朱文靜 夏建新

252000山東，聊城市人民醫院皮膚科（于凱）；吉林大學第二醫院皮膚科（王一宇、金仙花、李雪、朱文靜、夏建新）

目的檢測不同濃度阿維A、干擾素α（IFN?α）單獨或聯合應用對人皮膚T細胞淋巴瘤Hut78細胞株的增殖抑制作用及白細胞介素15（IL?15）表達的影響。方法將Hut78細胞分為空白對照組、陰性對照組、二甲基亞砜組（DMSO）和實驗組，其中實驗組分別用0.1～10μmol/L阿維A和5 000～20 000 IU/ml IFN?α單獨或1.0μmol/L阿維A聯合5 000～20 000 IU/m l IFN?α作用Hut78細胞，培養24、48、72 h后分別進行測定。CCK8法檢測細胞增殖情況，ELISA檢測藥物處理后細胞的白細胞介素15（IL?15）表達情況。結果各濃度阿維A或聯合作用組與DMSO組相比及IFN?α組與陰性對照組相比，Hut78細胞增殖和IL?15表達均受到明顯抑制，抑制作用隨濃度增加和時間延長而增強。重復測量方差分析顯示，阿維A、IFN?α單獨或聯合作用不同時間，細胞增殖抑制率和IL?15表達差異均有統計學意義（P＜0.05），不同作用濃度之間差異亦有統計學意義（均P＜0.05），作用時間與藥物濃度之間存在交互作用（均P＜0.05）。1.0μmol/L阿維A＋10 000或20 000 IU/ml IFN?α組與相應濃度藥物單獨作用組比較，細胞抑制率差異在24、48、72 h時均有統計學意義（P＜0.05）。1.0μmol/L阿維A+5 000 IU/m l IFN?α組在24、48、72 h時與5 000 IU/m l IFN?α組相比，IL?15表達差異均有統計學意義（P＜0.05）；1.0μmol/L阿維A＋10 000或20 000 IU/ml IFN?α組與相應濃度藥物單獨作用組之間IL?15表達差異在24、48、72 h時均有統計學意義（P＜0.05）。結論阿維A和IFN?α均對Hut78細胞的增殖有抑制作用，均可下調Hut78細胞IL?15的表達，這種作用隨著濃度的增加和時間的延長而增強，且兩者聯合用藥優于單獨用藥。

淋巴瘤，T細胞，皮膚；阿維A；干擾素α；白介素15；細胞增殖；細胞系，腫瘤；Hut78細胞

維A酸類藥物是一組與天然維生素A結構類似的化合物，可調節上皮細胞等的生長和分化，對惡性細胞生長有抑制作用，還可調節免疫和炎癥過程等。干擾素（IFN）是病毒或其誘導劑誘導人體細胞產生的一種糖蛋白，有病毒抑制、抗腫瘤及免疫調節作用。IFN?α?2b被廣泛用于皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）的治療，可以有效控制早期蕈樣肉芽腫，對腫瘤期患者及Sézary綜合征患者也是一線治療藥物［1］。我們通過體外培養人T細胞淋巴瘤細胞株Hut78，觀察阿維A和IFN?α對細胞生長的影響，初步探討其作用機制，為臨床治療皮膚T細胞淋巴瘤提供新的思路。

一、材料和方法

1.細胞、試劑和儀器：人T細胞淋巴瘤細胞株Hut78來自中國科學院上海細胞庫。培養基為含20%胎牛血清的IMDM（Iscove′smodified Dulbeccomedium，美國Gibco公司），并添加100 U/m l青霉素和100 g/L鏈霉素（上海譜振生物科技有限公司）。阿維A膠囊（重慶華邦公司惠贈，規格：10mg，產品批號：2012034），重組人IFN?α?2b注射液（天津華立達生物工程有限公司惠贈，規格：300萬IU/ml，批號：sa120601），CCK8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、人白細胞介素15（IL?15）ELISA試劑盒（武漢博士德生物有限公司），二甲基亞砜（DMSO）來自北京化學試劑公司。

2.藥物配制：避光條件下稱取阿維A粉末（純度＞99.0%），用DMSO配制成10mmol/L，吹打混勻，過濾除菌，分裝于1.5ml Eppendorf管中，置于-20℃冰箱避光儲存。使用前用IMDM培養液稀釋成3個濃度：0.1、1.0、10μmol/L，即配即用。用IMDM培養基稀釋IFN?α至終濃度5 000、10 000、20 000 IU/ml，即用即配。

3.細胞分組及處理：設空白對照組（只加入培養基）、陰性對照組（只加入單細胞懸液）、DMSO組（加入單細胞懸液，DMSO體積分數為0.1%）和實驗組，實驗組又分為阿維A組、IFN?α組、聯合組，阿維A組細胞分別用0.1、1.0、10μmol/L阿維A處理［2］，IFN?α組分別用5 000、10 000、20 000 IU/ml IFN?α處理［3］；預實驗中10μmol/L阿維A對細胞增殖抑制作用極其明顯，為避免其掩蓋不同濃度IFN?α所產生的影響，故聯合組細胞分別用1.0μmol/L阿維A＋5 000 IU/ml IFN?α、1.0μmol/L阿維A＋10 000 IU/m l IFN?α、1.0μmol/L阿維A＋20 000 IU/ml IFN?α處理。各組每個藥物濃度分別設3個復孔，各孔最終體積均為100μl，細胞濃度為4×104個/ml。將細胞置于96孔板上，在37℃、5%CO2的培養箱中培養，直到細胞胞質飽滿、均勻懸浮于視野方可加藥，聯合組兩種藥物同時加入。加藥后于培養箱中培養24、48、72 h后分別進行測定。

4.電鏡下觀察細胞形態：于藥物干預后24、48、72 h在電鏡下觀察各組細胞形態，并拍照。

5.CCK8法檢測細胞增殖：在細胞培養結束前1 h，每孔加入10μlCCK?8溶液，繼續孵育1 h。用全自動酶標儀于波長450 nm處測定吸光度（A值），根據以下公式計算細胞增殖抑制率，抑制率（%）=（1-試驗組A值/陰性對照組A值）×100%。

6.ELISA測定阿維A及IFN?α作用前后人Hut78細胞IL?15表達情況：將藥物干預后的細胞懸液吸出、離心，按原分組將90μl上清液置于已包被抗體的酶標板孔中，并增加1孔作為空白顯色孔，同時設不同濃度標準品對照孔和調零孔，按照試劑盒說明書操作，最后用酶標儀在450 nm波長處測定A值。根據標準曲線確定樣品IL?15表達水平。

二、結果

1.阿維A、IFN?α對Hut78細胞增殖的影響：見表1。

（1）阿維A組：與DMSO組相比，阿維A組Hut78細胞增殖受到明顯抑制，隨著濃度的增加和時間的延長，抑制作用逐漸增強，以10.0μmol/L阿維A作用72 h的抑制率最高。不同作用時間之間增殖抑制率差異有統計學意義（F=1 261.413，P＜0.05），作用時間與藥物濃度之間存在交互作用（F=16.879，P＜0.05），不同藥物濃度之間增殖抑制率差異有統計學意義（F=92.503，P＜0.05）。

（2）IFN?α組：與陰性對照組相比，IFN?α組Hut78細胞增殖受到明顯抑制，隨著濃度的增加和時間的延長，抑制作用逐漸增強，且以20 000 IU/m l IFN?α組作用72 h的抑制率最高。不同作用時間之間及不同藥物濃度之間增殖抑制率差異均有統計學意義（F=744.426、165.536，P＜0.05），作用時間與藥物濃度之間存在交互作用（F=21.300，P＜0.05）。

（3）阿維A和IFN?α聯合組：與DMSO組相比，1.0μmol/L阿維A聯合不同濃度IFN?α對Hut78細胞有明顯的增殖抑制作用，隨著IFN?α濃度增加和藥物作用時間延長，抑制作用逐漸增強，且以阿維A+20 000 IU/ml IFN?α組作用72 h的抑制率最高。不同作用時間之間及不同藥物濃度之間增殖抑制率差異均有統計學意義（F=2 927.877、417.025，P＜0.05），作用時間與藥物濃度之間存在交互作用（F=66.586，P＜0.05）。

1.0 μmol/L阿維A＋5 000 IU/ml IFN?α組與1.0μmol/L阿維A組及5 000 IU/ml IFN?α組之間細胞抑制率差異在24、48、72 h時均無統計學意義（P＞0.05）；1.0μmol/L阿維A＋10 000 IU/ml IFN?α組與1.0μmol/L阿維A組及10 000 IU/ml IFN?α組之間、1.0μmol/L阿維A＋20 000 IU/m l IFN?α組與1.0μmol/L阿維A組及20 000 IU/m l IFN?α組之間細胞抑制率差異在24、48、72 h時均有統計學意義（P＜0.05）。

2.倒置顯微鏡觀察細胞形態變化：陰性對照組細胞生長良好，大小較一致，部分抱團生長，呈圓形或橢圓形，胞質飽滿，細胞膜完整，折光性好，圓形胞核居胞質中央；經阿維A和IFN?α作用后，細胞生長慢，細胞形態發生顯著變化，細胞皺縮、破碎，部分形成細胞碎片，失去原有的形態，折光性差，隨著作用時間的延長，細胞數明顯減少。見圖1。

表1 阿維A和干擾素（IFN）?α單獨或聯合作用不同時間對Hut78細胞增殖以及白細胞介素15（IL?15）蛋白表達的影響（±s）

表1 阿維A和干擾素（IFN）?α單獨或聯合作用不同時間對Hut78細胞增殖以及白細胞介素15（IL?15）蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。a：與二甲基亞砜組相比，P＜0.05；b：與陰性對照組相比，P＜0.05；c：與1.0μmol/L阿維A組及10 000 IU/ml干擾素組相比，P＜0.05；d：與1.0μmol/L阿維A組及20 000 IU/m l干擾素組相比，P＜0.05

組別二甲基亞砜組陰性對照組阿維A組0.1μmol/L 1.0μmol/L 10μmol/L干擾素組5 000 IU/m l 10 000 IU/m l 20 000 IU/m l 1.0μmol/L阿維A聯合組+5 000 IU/m l干擾素+10 000 IU/ml干擾素+20 000 IU/m l干擾素24 h增殖抑制率（%）0.08±0.005-11.21±0.89a 19.01±3.23a 25.99±2.33a 12.23±1.58b 18.12±1.26b 24.33±1.86b 17.89±2.58a 29.66±1.32ac 40.33±1.55ad IL?15（ng/L）606.23±9.41 613.81±8.24 548.46±5.66a 497.61±6.25a 461.32±4.22a 535.69±6.55b 488.03±5.33b 450.73±5.68b 491.95±6.34a 450.30±5.22ac 394.79±4.89ad 48 h增殖抑制率（%）0.04±0.003-27.89±2.11a 36.33±3.56a 44.82±2.25a 19.75±1.33b 28.22±2.01b 41.86±3.24b 38.20±1.35a 51.09±1.76ac 69.02±3.09ad IL?15（ng/L）701.30±8.27 691.36±10.25 486.15±5.33a 448.25±4.39a 402.63±6.33a 472.95±5.66b 439.97±2.32b 395.09±5.42b 444.33±5.95a 380.28±4.95ac 339.32±5.02ad 72 h增殖抑制率（%）0.03±0.001-35.69±1.98a 45.88±2.26a 60.95±4.32a 27.96±2.25b 40.32±1.66b 49.28±3.01b 43.52±2.21a 69.49±2.12ac 80.11±3.21ad IL?15（ng/L）760.27±11.18 780.68±12.33 399.01±4.92a 358.36±2.62a 293.14±4.23a 380.72±6.52b 338.02±3.72b 280.07±3.55b 342.68±6.22a 275.71±5.32ac 194.68±3.33ad

3.Hut78細胞IL?15表達情況：見表1。

（1）阿維A組：與DMSO組相比，阿維A在0.1～10.0μmol/L濃度范圍內對Hut78細胞IL?15的表達有明顯抑制作用，隨著濃度增加和時間延長，抑制作用逐漸增強，且以10.0μmol/L濃度組作用72 h的抑制率最高。不同作用時間之間及不同藥物濃度之間IL?15表達水平差異均有統計學意義（F=24 269.350、260.245，P＜0.05），作用時間與藥物濃度之間存在交互作用（F=87.572，P＜0.05）。

圖1不同組Hut78細胞培養48 h后生長情況（×100）1A：陰性對照組細胞生長良好，大小較一致，部分抱團生長，呈圓形或橢圓形，胞質飽滿，胞膜完整，折光性好，圓形胞核居胞質中央；1B～1D：分別為1.0μmol/L阿維A組、10 000 IU/m l干擾素α組、1.0μmol/L阿維A+10 000 IU/m l干擾素α組，細胞形態發生顯著變化，細胞皺縮、破碎，部分形成細胞碎片，失去原有的形態，折光性差。聯合組細胞皺縮、破碎的程度更加明顯

（2）IFN?α組：與陰性對照組相比，IFN?α對Hut78細胞IL?15的表達有明顯抑制作用，隨著濃度增加和時間延長，抑制作用逐漸增強，且以20 000 IU/ml濃度組作用72 h的抑制率最高。不同作用時間之間及不同藥物濃度之間IL?15表達水平差異均有統計學意義（F=3 524.983、390.785，P＜0.05），作用時間與藥物濃度之間存在交互作用（F=9.553，P＜0.05）。

（3）阿維A和IFN?α聯合組：與DMSO組相比，阿維A聯合IFN?α對Hut78細胞IL?15的表達有明顯的抑制作用，隨著濃度增加和時間延長，抑制作用逐漸增強，且以1.0μmol/L阿維A和20 000 IU/ml IFN?α聯合作用72 h的抑制率最高。不同作用時間之間及不同藥物濃度之間IL?15表達水平差異均有統計學意義（F=133 039.386、336.793，P＜0.05），作用時間與藥物濃度之間存在交互作用（F=1 158.045，P＜0.05）。

1.0 μmol/L阿維A＋5 000 IU/m l IFN?α組在24、48 h時與1.0μmol/L阿維A組相比IL?15表達差異均無統計學意義（P＞0.05），在24、48、72 h時與5 000 IU/ml IFN?α組相比IL?15表達差異均有統計學意義（P＜0.05）；1.0μmol/L阿維A＋10 000 IU/ml IFN?α組與1.0μmol/L阿維A組及10 000 IU/ml IFN?α組之間、1.0μmol/L阿維A＋20 000 IU/ml IFN?α組與1.0μmol/L阿維A組及20 000 IU/m l IFN?α組之間IL?15表達在24、48、72 h時差異均有統計學意義（P＜0.05）。

三、討論

阿維A臨床上主要用于治療各型銀屑病和角化性皮膚病等［4?5］。近年來，其抗腫瘤作用日益受到重視［6］。某些類型腫瘤對維A酸的敏感性低，探索其他藥物與維A酸的聯合應用是必要的。IFN?α通過介導抗血管生成作用和激活免疫反應，發揮抗增殖和誘導凋亡的作用［7?8］，IFN?α?2b已被廣泛用于治療CTCL，但其具體治療機制尚未明確。我們體外評估阿維A和IFN?α單獨或聯合應用對Hut78細胞增殖的影響，并初步探討其作用機制。

我們發現，阿維A和IFN?α均可抑制Hut78細胞增殖，并且呈濃度依賴性。隨著作用時間延長，阿維A和IFN?α對Hut78細胞的增殖抑制作用逐漸增強，表現出時間依賴性。而且，阿維A聯合IFN?α的抑制率高于二者單獨用藥，表明兩藥聯合應用有協同作用，可有效抑制CTCL的生長。

有文獻報道，人急性T淋巴細胞白血病、CTCL腫瘤細胞表達IL?15Rα，IL?15能夠和其受體結合，促進腫瘤細胞增殖［9］。研究發現，CTCL中IL?15和IL?16過度表達［10］。但也有文獻報道，IFN通過上調IL?15發揮抗腫瘤作用［11］。本研究結果顯示，阿維A、IFN?α均可抑制Hut78細胞表達IL?15，并呈劑量依賴性。隨著作用時間延長，不同濃度阿維A和IFN對Hut78細胞IL?15表達的抑制作用逐漸增強。并且阿維A與IFN?α聯合應用有協同作用。本研究結論與IFN可作用于多種細胞產生IL?15的結論［11］相反，推測原因可能是：①阿維A與IFN?α誘導Hut78細胞的凋亡作用大于促進IL?15表達的作用，從而間接導致Hut78細胞表達IL?15的總量減少；②體內外環境不同導致IFN抗腫瘤的機制產生變化。

本研究表明，阿維A可協同IFN?α對人皮膚T細胞淋巴瘤Hut78的增殖產生抑制作用，為皮膚T細胞淋巴瘤的臨床治療提供了新的思路和理論依據。

［1］Criscione VD,Weinstock MA.Incidence of cutaneous T?cell lymphoma in the United States,1973?2002［J］.Arch Dermatol,2007,143（7）:854?859.DOI:10.1001/archderm.143.7.854.

［2］劉雁.阿維A酸聯合干擾素對小鼠黑色素瘤細胞株B16作用的研究［D］.石家莊,河北醫科大學,2009.DOI:10.7666/d.y1636541.Liu Y.The mechanism of acitretin combined INF on malignant melanoma B16 cells［D］.Shijiazhuang,HebeiMedical University,2009.DOI:10.7666/d.y1636541.

［3］谷曉廣,汪旸,張高磊.IFN?α對人皮膚淋巴瘤細胞系Hut78的影響［J］.中國皮膚性病學雜志,2012,26（10）:871?874,879.Gu XG,Wang Y,Zhang GL.The effects of IFN?αon human cutaneous T?cell lymphoma cell line Hut78［J］.Chin J Dermatovenereol,2012,26（10）:871?879.

［4］Lee CS,Koo J.A review of acitretin,a systemic retinoid for the treatment of psoriasis［J］.Expert Opin Pharmacother,2005,6（10）:1725?1734.

［5］羅權,張錫寶.阿維A治療兒童角化性疾病的研究現狀［J］.國際皮膚性病學雜志,2006,32（3）:136?138.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673?4173.2006.03.002.Luo Q,Zhang XB.Acitretin in the treatment of cutaneous disorders of keratinization in children［J］.Int JDermatol Venereol,2006,32（3）:136?138.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673?4173.2006.03.002.

［6］Otley CC,Stasko T,Tope WD,et al.Chemoprevention of nonmelanoma skin cancer with systemic retinoids:practical dosing and management of adverse effects［J］.Dermatol Surg,2006,32（4）:562?568.DOI:10.1111/j.1524?4725.2006.32115.x.

［7］Ahtiainen L,Mirantes C,Jahkola T,et al.Defects in innate immunity render breast cancer initiating cells permissive to oncolytic adenovirus［J/OL］.PLoS One,2010,5（11）:e13859［2014?01?03］.http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0013859.DOI:10.1371/journal.pone.0013859.

［8］Williams RF,Sims TL,Tracey L,et al.Maturation of tumor vasculature by interferon?beta disrupts the vascular niche of glioma stem cells［J］.Anticancer Res,2010,30（9）:3301?3308.

［9］Kukita T,Arima N,Matsushita K,etal.Autocrineand/or paracrine growth of adult T?cell leukaemia tumour cells by interleukin 15［J］.Br JHaematol,2002,119（2）:467?474.

［10］Leroy S,Dubois S,Tenaud I,et al.Interleukin?15 expression in cutaneous T?cell lymphoma（mycosis fungoides and Sézary syndrome）［J］.Br JDermatol,2001,144（5）:1016?1023.

［11］Fuertes MB,Woo SR,Burnett B,etal.Type I interferon response and innate immune sensing of cancer［J］.Trends Immunol,2013,34（2）:67?73.DOI:10.1016/j.it.2012.10.004.

Effects of acitretin and interferon on the proliferative activity of and interleukin?15 expression in a human cutaneous T?cell lymphoma cell lineHut78

Yu Kai,Wang Yiyu,Jin Xianhua,LiXue,ZhuWenjing,Xia Jianxin

Department ofDermatology,Liaocheng People′s Hospital,Liaocheng 252000,Shandong,China（Yu K）;Department of Dermatology,The Second Hospital ofJilin University,Changchun 130041,China（Wang YY,Jin XH,LiX,ZhuWJ,Xia JX）

Xia Jianxin,Email:911469806@qq.com

Objective To evaluate effects of acitretin and interferon?α（INF?α）alone or in combination on the proliferative activity of and interleukin?15 expression in human cutaneous T?cell lymphoma Hut78 cells.M ethods Cultured Hut78 cellswere divided into severalgroups,including blank controlgroup,negative control group,dimethyl sulphoxide（DMSO）group and experimental groups.Cells in experimental groups were additionally classified into severalsubgroups tobe treatedwith acitretin（0.1-10μmol/L,acitretin groups）or INF?α（5 000-20 000 IU/ml,INF?α groups）alone,or the combination of 1.0μmol/L acitretin and IFN?αat concentrations of 5 000-20 000 IU/m l（combination groups）,for24,48 and 72 hours.Subsequently,cell counting kit8（CCK8）assaywasperformed toassess the proliferative activity ofHut78 cells,and enzyme?linked immunosorbentassay（ELISA）tomeasure the expression of IL?15 in these cells.Results The proliferative activity of and IL?15 expression in Hut78 cellswere both obviously suppressed in the acitretin groups and combination groups compared with the DMSO group,aswell as in the INF?α groups compared with the negative control group,and the inhibitory effects gradually increased with the increase in acitretin or INF?αconcentrations and treatment durations.As repeatedmeasures analysis of variance revealed,there wasasignificantdifference in both proliferation inhibition ratesand IL?15 expression amongdifferent treatmentdurations and among different concentrations of acitretin or INF?α（allP＜0.05）,and there was an interaction effect between treatment durations and drug concentrations（allP＜0.05）.A significant differencewas observed in both proliferation inhibition rates and IL?15 expression at 24,48 and 72 hourswhen the 1.0?μmol/L acitretin+10 000/20 000?IU/ml IFN?αgroup was compared with the 1.0?μmol/L acitretin group and 10 000/20 000 IU/ml IFN?αgroup（allP＜0.05）.There was also a significantdifference in IL?15 expression at24,48 and 72 hours between the 1.0?μmol/L acitretin+50 000?IU/ml IFN?αgroup and 5 000?IU/ml IFN?αgroup（allP＜0.05）.Conclusions Acitretin and IFN?αboth can inhibit the proliferation ofand IL?15 expression in Hut78 cells,the inhibitory effects are enhanced with the increase in drug concentrations and treatment durations,and the combination of acitretin and IFN?αappears to have stronger inhibitory effects than acitretin or IFN?αalone.

Lymphoma,T?cell,cutaneous;Acitretin;Interferon?alpha;Interleukin?15;Cell proliferation;Cell line,tumor;Hut78 cells

夏建新，Email：911469806@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.11.013

吉林省科技發展項目（20130413015GH）

Fund program:Science and Technology DevelopmentProjectof Jilin Province（20130413015GH）

2015?09?11）

（本文編輯：尚淑賢）