磁微粒-吖啶酯化學發光游離甲狀腺素檢測試劑的研制及應用

張建鋒

(英科新創/廈門科技有限公司，福建廈門 361022)

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·臨床研究·

磁微粒-吖啶酯化學發光游離甲狀腺素檢測試劑的研制及應用

張建鋒

(英科新創/廈門科技有限公司，福建廈門 361022)

目的研制定量檢測游離甲狀腺素的化學發光免疫試劑。方法制備吖啶酯-T4結合物作為信號標記物質，制備鏈霉親和素-磁性微球作為固相載體，結合生物素標記的甲狀腺素(T4)抗體，建立小分子競爭法免疫分析體系，分析其靈敏度、準確度和線性范圍等性能指標。結果靈敏度為1.5 pmol/L，線性范圍2～75 pmol/L，批內不精密度CV為5.62%～8.24%，批間不精密度CV為7.08%～9.82%，與T3和rT3無交叉反應，37 ℃ 6 d后發光值降幅為10.7%～14.6%，檢測100例臨床血清標本，測定結果與進口試劑的相關性r值等于0.924 5。結論該試劑具有靈敏度高、線性范圍廣、穩定性好、受環境影響小、檢測結果準確等特點，可配套全自動化學發光免疫分析系統，應用于臨床檢測。

游離甲狀腺素；化學發光；吖啶酯；磁性微球

甲狀腺素(T4)是甲狀腺濾泡細胞合成及分泌的激素。體內游離的甲狀腺素(FT4)通過維持體溫及刺激熱量生成來調節正常生長與發育，其含量與甲狀腺功能狀態密切有關。檢測FT4 水平并結合其他甲狀腺檢驗和臨床表現，可對甲狀腺功能亢進和甲狀腺功能減退作出診斷[1]。血清FT4檢測方法有平衡透析法、放射免疫測定法、酶免疫測定法、時間分辨熒光免疫法和化學發光免疫分析法等[2-6]。其中化學發光免疫分析法是最具發展前景的新型非放射性免疫標記技術。本研究成功制備小分子-吖啶酯結合物，基于小分子物質的競爭法檢測原理，研制定量檢測FT4的磁性微球-吖啶酯標記-化學發光免疫分析試劑。報道如下。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑LB960型化學發光讀數儀(Berthold公司)，2695-2696液相色譜儀(Waters公司)，DXI800全自動免疫分析系統(Beckman公司)。T4單抗、鏈霉親合素(SA)購自羅氏公司；生物素、脫鹽柱購自Thermo fisher公司；NSP-DMAE-NHS購自上海邁拓崴公司； T4標準品購自中國藥品生物制品檢定所；T4純品、 BSA購自Sigma公司，臨床標本來自福建醫科大學附屬協和醫院。其他試劑均購自阿拉丁試劑公司。

1.2試劑組分制備

1.2.1SA磁性微球制備按照摩爾比2∶1稱取適量氯化鐵和氯化亞鐵，在超純水中溶解混勻后加入氨水至終濃度為0.5%，60 ℃攪拌反應4 h，所得磁性微球用超純水洗滌后，重新分散于50%乙醇中，再依次加入0.5%的PEG4000、0.1%的氨水和0.1%的正硅酸乙酯，60 ℃攪拌反應16 h，獲得改性后的磁性微球用超純水和無水乙醇交替洗滌后，重懸于50%乙醇中，再分別加入0.05%的氨水、0.5%的四甲基氫氧化銨(TMA)和2.5%的3-氨丙基三甲氧基硅烷，室溫攪拌反應16 h，即得表面修飾氨基的磁性微球。取適量該氨基磁性微球，用PBS緩沖液清洗并重懸，再加入0.1% TMA和2.5%的戊二醛，室溫攪拌反應30 min，之后用碳酸緩沖液清洗并重懸，超聲分散后按20 μg/mg磁性微球加入SA，37 ℃攪拌反應16 h，然后分別加入0.1%的谷氨酸和1%的BSA繼續反應1 h， PBS緩沖液(含0.05%的tween-20)洗滌3次后，重懸于1% BSA中，超聲分散，即得SA磁性微球。

1.2.2生物素化抗體制備取適量Anti-T4單抗，pH 7.4的PBS緩沖液透析純化后，加入15倍(摩爾比)已活化的長鏈磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，2～8 ℃反應2 h，再轉入室溫繼續反應30 min，最后加入100倍(摩爾比)的賴氨酸反應30 min，反應液用脫鹽柱純化，加入等體積甘油和0.1% NaN3。

1.2.3吖啶酯-T4結合物制備稱取T4純品適量，溶于DMSO中，配制濃度為0.1 mmol/L的溶液A。再稱取NSP-DMAE-NHS適量，溶于無水DMF中，配制濃度為10 mmol/L的溶液B。取溶液B 5.0 mL，加入三乙胺(TEA)2 mg，再加入溶液B 5.0 mL，最后用0.05 mol/L pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋至總體積10 mL，室溫攪拌反應16 h，產物經制備色譜純化，獲得吖啶酯-T4結合物。

1.2.4FT4標準品配制稱取適量T4標準品[7]，溶解于適量無激素血清中，配制成濃度為0.1 mmol/L的儲備液，再用無激素血清將儲備液稀釋為S0、S1、S2、S3、S4、S5共6個校準點，濃度分別為0、2、5、10、25、75 pmol/L。

1.2.5底物激發液配制激發液A：0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3；激發液B：0.2 mol/L NaOH+2% Triton X-100。

1.3方法及原理微孔中依次加入50 μL 的標本、吖啶酯-T4結合物、生物素化抗體和SA磁性微球，37 ℃溫育15 min，洗滌5次，加激發液A和B各100 μL，讀取相對發光值。反應原理為一步競爭法。標本中待測的游離T4抗原與吖啶酯標記的T4抗原相互競爭結合有限的生物素化抗體，最終吖啶酯所產生的發光值與標本中的FT4含量呈反向相關。

2　結　　果

圖1　　FT4測定標準曲線(劑量-反應曲線)

2.3特異度將易發生交叉反應的物質T3和rT3分別稀釋至500 ng/mL和50 ng/mL，作為標本進行檢測，高濃度T3和rT3對檢測無明顯干擾，其濃度均小于1.5 pmol/L。

圖2　　熱穩定性試驗結果

2.4熱穩定度將全套試劑組分37 ℃放置6 d后， 分析其標準品測試性能，通過與放置前的信號強度比值，確定熱穩定性的變化幅度，均小于15%。見圖2。

2.5準確度采用FT4標準品進行測試，使用Log-Logit數學模型擬合，分析實際測試值與理論值的偏差，準確度測試偏差小于10%。見表1。

表1　　準確度試驗結果

2.6與其他廠家試劑的相關性用全套試劑對100例臨床標本進行檢測，高、中、低值標本分別為21、29、50例，與貝克曼DXI800全自動化學發光系統檢測值進行比較，相關性較好(r2=0.854 7)。見圖3。

圖3　　與貝克曼全自動化學發光免疫分析系統的相關性

3　討　　論

血液循環中絕大部分T4與載體蛋白相結合，只有0.03% 的T4 處于游離狀態(FT4)。檢測FT4不受甲狀腺球蛋白影響，可特異性地反映甲狀腺的功能狀態，因此在疾病診斷、病情評估、療效監測等方面具有重要的臨床應用價值，成為判斷甲狀腺功能最靈敏的一項參考指標[8]。

目前有研究報道， FT4化學發光免疫檢測方法的免疫固相載體主要有微孔和磁性微球2種[9-10]。磁性微球通過化學鍵偶聯蛋白，具有結合牢固、重復性好、反應高效、易于儲存和自動化等特點，是較為先進的固相載體。信號標記物主要是間接發光的酶標記，包括辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，而采用吖啶酯(AE)直接標記游離甲狀腺素研究較少。AE標記物背景信號低、發光效率高，且不需要酶催化，受環境因素干擾較小，且其底物比酶促系統底物更加穩定[11]。因此，吖啶類物質作為信號標記物，對試劑的靈敏度、精密度等都有很大提高。

本研究成功將吖啶酯作為信號物質與小分子甲狀腺素進行標記，采用小分子競爭法原理，引入磁性微球作為固相載體，并結合鏈霉親和素-生物素系統，開發出性能優良的FT4檢測試劑，具有重要的臨床應用價值，對相關科研也有一定的參考意義。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.052

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1673-4130(2016)19-2773-03

2016-03-20

2016-05-25)