過氧化物酶催化聚合的應用進展

張麗華，蔣俊峰，田麗萍，李 江

(山西大同大學化學與環境工程學院，山西大同037009)

過氧化物酶催化聚合的應用進展

張麗華，蔣俊峰，田麗萍，李 江

(山西大同大學化學與環境工程學院，山西大同037009)

過氧化物酶屬于生物酶的一個重要的組成部分，能夠催化低分子量的有機物和無機物生成相關的聚合產物。它比一般的生物酶具有更高的選擇性和催化效率，反應條件也比較溫和，已被廣泛的應用到科學研究、社會生產和社會生活的許多方面。本文綜合概述了5種不同過氧化物酶的結構、催化機理以及它們在催化聚合方面的應用進展。

過氧化物酶；催化聚合；應用

有些酶在非水介質中同樣具有較高的活性以及穩定性，能夠催化生成一些常規方法難以合成的物質。過氧化物酶就是其中一種用途廣泛的酶，根據來源不同將其分為3個基本的類型：動物過氧化物酶、植物過氧化物酶、真菌過氧化物酶。近來，隨著研究的不斷深入，人們又發現許多新興的過氧化物酶。過氧化物酶可以在過氧化物如過氧化氫存在的環境下，催化多種化合物，被廣泛應用于很多領域。本文主要介紹了辣根過氧化物酶、氯過氧化物酶、漆酶、錳過氧化物酶，木質素過氧化物酶的結構、催化機理以及它們在催化聚合方面的應用進展。

1 辣根過氧化物酶(HRP)

辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase)是一種含血紅素的生物酶，是最先開始商品化生產、應用領域最寬、研究得最細致的植物過氧化物酶。在20世紀初就已經有人從辣根中將其提取出來，隨后人們嘗試將其固定化。它的催化活性高、耐熱性強、對酸和堿的穩定性好，對污染物濃度以及鹽度的耐受性較高，與抗原或者抗體進行偶聯之后，酶活性損失很少，被廣泛應用于醫學、有機合成、環境保護等多個領域[1]。

1.1 辣根過氧化物酶的結構

HRP-C包含308個氨基酸殘基，輔助基團為血紅素，相對分子質量4.4×104，等電點范圍3.0～9.0，通過測定其氨基酸的序列發現，HRP的N末端連有一個羧酸基團，而C的末端連接的絲氨酸易于離去，肽鏈中有4個二硫鍵，它們是由半胱氨酸組成[2]，結構如圖1所示。

圖1 HRP-C的結構

1.2 辣根過氧化物酶的催化機理

在H2O2存在下，HRP能催化聚合一系列的芳香胺、酚類[3]。通過研究，科學家認為，HRP的催化機理是以下的循環反應：

總反應式:2RH+H2O2→R-R+2H2O

1.3 辣根過氧化物酶催化聚合的應用進展

1.3.1 醫學領域

2016年，Laura等[5]在過氧化氫存在的條件下，用辣根過氧化物酶催化金納米棒引導配體的不均勻分布和選擇性腐蝕。結果表明，在含硫有機物，如谷胱甘肽、硫代膽堿酶存在的情況下，金納米棒蝕刻發生變形，這種效果能用來檢測乙酰膽堿酯酶的活性，將疼痛產生的硫代膽堿催化分解。

1.3.2 有機合成

2014年，Sepa等人[6]將辣根過氧化物酶固定在硅納米棒上，并用其催化甲苯聚合生成2,6-二甲基-1,4苯醚。固定化以后的酶活性顯著增強，并且可以重復利用。2016年，Wang等[7]將辣根過氧化物酶、雙氧水和乙酰丙酮成功地應用到催化淀粉聚合生成聚甲基丙烯酸甲酯的過程中。

1.3.3 污水處理

2015年，程龍[8]通過自發進行拼裝以及反復的制備過程，把MWCNT（多壁碳納米管）結合到堇青石上。得到了制備該復合載體的最佳方法：使用AEAPTS（硅烷偶聯試劑）8-wt%，pH=3.5，T=50℃，使用MWCNT 0.5-wt%，并在150℃條件下真空干燥3次。將辣根過氧化物酶固定到該載體上，提高了酶活性和對環境的穩定性以及可反復利用性。之后將固定好的HRP用來處理含油的廢水，油污的凈化程度高達70%以上。

2 氯過氧化物酶(CPO)

氯過氧化物酶(Chloroperoxidase)兼多種過氧化物酶的催化性能，被廣泛應用于醫藥生產、有機合成、染料降解等領域。氯過氧化物酶主要是從海洋真菌(Calderiomyces fumago)分離而來，電子接收體通常是過氧化氫類的物質。另外，CPO的空間選擇性高，可以催化多種反應。如鹵化反應、烯烴的環氧化反應等。

2.1 氯過氧化物酶的結構

CPO的相對分子質量約是42 kDa，等電點范圍3.2～4.0，本質為糖蛋白酶。分子中有亞鐵血紅素，5%～30%的糖類物質，312個氨基酸殘基基團，包括天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸等。CPO輔基的特征活性位點結構：血紅素的近端配位基團與細胞色素P-450非常相似，第5軸位置以半胱氨酸(Cys29)中的硫來替換組氨酸的氮原子，遠端的有效催化組分是谷氨酸(Glul83)[9]。CPO的活性位點結構如圖2。

圖2 CPO的活性位點結構

2.2 氯過氧化物酶的催化機理

初始的CPO活性中心包含鐵卟啉環Fe3+，加入雙氧水之后，雙氧水發生異裂，血紅素中的2個電子開始轉移，氯過氧化物酶生成compound I和1個水分子，陽離子中間體compound I的穩定性差但是氧化性高[10]，能催化多種底物，具體催化機理如圖3。

圖3 CPO的催化機理

2.3 氯過氧化物酶催化聚合的應用進展

2.3.1 醫藥領域

2015年，李曉紅[11]以氯過氧化物酶為催化劑、H2O2作氧化劑，處理了3類抗生素。結果顯示，在適宜的條件下，pH維持在3～5的區間內；雙氧水濃度約為(0.1～0.12 mmol/L-1)范圍內；降解率可在10～20 min之內可高達100%，顯示出相當誘人的前景。

這是從《全芳備祖》有關信息勾勒的大致經歷，由于材料的稀缺，整個履歷是極為模糊的。只能大致感覺到，他應屬于當時的江湖游士一族，未見有科舉、仕宦的任何信息，布衣終身，一生大部分時間都在江淮、湘贛、浙閩等地尤其是江淮之間漫游、客居。

2.3.2 有機合成

2012年，汪麗敏[12]對CPO催化二苯甲基硫代乙酰胺合成R-型莫達非尼的途徑及其影響展開研究，還考察了添加劑對CPO催化活性的改變情況。實驗結果：共溶劑能明顯改善酶和底物的結合和酶的專一性，增大產物產率；GOD（葡萄糖氧化酶）氧化葡萄糖在線產生H2O2能將H2O2不斷緩釋到體系中，與常規的人工添加H2O2比較，能延長CPO保持活性的時間，產物的產率從32.4%增加至36.4%。

2.3.3 染料脫色

2014年，Jiao等[13]將氯過氧化物酶固定在孔狀的二氧化硅材料上。由于二氧化硅載體具有只讓少數的酶進入并且為CPO提供足夠大的空間的優良性質，從而利于酶充分發揮催化效力。隨后，用固定后的CPO對含氮染料進行脫色，效率高達90%以上。

3 漆酶

漆酶(Laccase)是一種呈現藍色的多銅氧化酶。19世紀80年代初，吉田首次從漆樹的漆液中分離出一種能夠把漆催化固化的蛋白質。1894年，Ber?trand把它命名成漆酶。漆酶主要分布在真菌的分泌物當中，漆酶在污染治理、紡織、土壤的改良等方面發揮著不可替代的作用。

3.1 漆酶的結構特征

漆酶分子通常有4個銅原子，它們分布在3個結合位點中。漆酶可以使氧氣還原成水。漆酶通常由500～600個氨基酸組成。每個酶分子由3個環狀結構組成，呈球狀結構[17]，如圖4。

圖4 漆酶的結構

3.2 漆酶的催化機理

漆酶可以將底物徹底催化，使羥基和氨基失去鄰、對位活潑氫原子，從而將氧還原為水。漆酶有單電子，在催化歷程中，底物結合到漆酶I型Cu2+位點上，經由半胱氨酸-組氨酸(Cys-His)再把電子轉移到三核位點處，隨后把電子傳到氧分子，并使其還原為水[14]，機理如圖5。

3.3 漆酶催化聚合的應用進展

3.3.1 醫學領域

2010年，Zhang等[15]利用大傘杯漆酶對腫瘤和HIV反轉錄酶的活性進行抑制，結果表明，隨著漆酶用量的提高，HepG2和MCF-7細胞生長都受到了抑制，抑制率分別是9.1%～80.5%和40.2%～95.4%，漆酶濃度是20 mmol/L時對HIV-RT的抑制率高達70.4%。漆酶還可以催化一些酚類物質生產抗菌素。

圖5 漆酶的催化機理

3.3.2 有機合成

2010年，Polak等[16]用固定化的漆酶催化含有氨基和羥基的苯磺酸發生反應，最后得到的聚合物通常用來作為染料。2014年，López等[17]在漆酶的催化作用下，經過一系列反應過程將氟和甲氧基取代的酚聚合成具有發光能力的聚合產物，在攝影方面發揮重要作用。

3.3.3 污水處理

2014年，季萬鎮等人[18]將2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)作為氯酚類物質的模型物，在曝氣的環境下，探究白腐菌Trametes hirsuta BYBF產漆酶對2,4-DCP的處理效果：結果發現2,4-DCP的去除率隨反應時間的延長而提高，當底物濃度是10 mmol/L，曝氣20 h之后的去除率高達93.6%。2,4-DCP的去除效果同時受諸多原因的影響，純化漆酶處理酚類物質的效果比粗漆酶要差一些。由于漆酶對溫度和酸堿度的耐受性高，2013年，Zhang[19]等人用漆酶對污染水體進行生物修復除去污染物孔雀石綠。

4 錳過氧化物酶(MnP)

在20世紀80年代初，美國的研究人員最早從黃孢原毛皮革菌當中將錳過氧化物酶(Manganese peroxidase)分離提取出來。它能氧化各種芳香化合物，具有很高的工業應用價值，目前已知58種真菌能夠產生錳過氧化物酶，多數為白腐真菌。

4.1 錳過氧化物酶的結構

錳過氧化物酶的結構中包含17%呈中性的糖類和眾多呈酸性的氨基酸。血紅素中只有1個可以與二價錳離子結合的位點，錳過氧化物酶能將二價錳離子氧化為三價錳離子，三價錳離子從過氧化物酶上脫離出來之后，若沒有適合的物質與之結合，就會失去穩定性，生成二氧化錳[20]。

4.2 錳過氧化物酶的催化機理

MnP的反應鏈包含了Fe3+，以及活性中間體CompoundⅠ和CompoundⅡ。起初，酶與H2O2相互結合將血紅素的電子傳遞給雙氧水，使其還原為水，其他物質聚集成一個龐大中間體。然后將一個螯合的Mn2+作為電子給予體把MnP-CompoundⅠ還原成MnP-CompoundⅡ，Mn2+被氧化為Mn3+，進而MnP-CompoundⅡ被一個螯合的Mn2+還原到初始形態完成循環過程，生成2分子H2O。Mn3+與有機酸螯合形成非常穩定的氧化還原電勢，螯合的Mn3+氧化酚類和有機酸。在高濃度的過氧化氫中MnP會很快失去活性[21]。見圖6。

圖6 錳過氧化物酶的催化機理

4.3 錳過氧化物酶催化聚合的應用進展

4.3.1 環境保護

2016年，張新憲[22]研究純化后的SQ01錳過氧化物酶對10種聯苯代謝產物的轉化能力，并對產物的結構進行探討。結果得知，錳過氧化物酶可以將聯苯以及同系物進行轉化，而這些物質在通常情況下難以被其他物質催化分解。該項研究為處理污水中的聯苯類有毒物質提供了新的途徑。2016年，Msgh?er等[23]從不同來源的云芝當中將錳過氧化物酶提取出來并對其性質進行考察，得到了酶活性最高的pH和溫度條件，用錳過氧化物酶催化不同的染料以及酚類有機物降解，都取得了令人滿意的結果。

4.3.2 造紙工業

2015年，唐瑤等[24]用錳過氧化物酶催化紙漿中的木素進行分解，經過處理之后紙張各方面的性質都有所改觀，同時還能減少造紙過程中所用的能源，除此之外，研究了錳過氧化物酶對造紙產生的黑色廢液的脫色降解效果。

4.3.3 染料脫色

2015年，鄭苗苗等[25]用錳過氧化物酶對4種不同染料的脫色情況進行研究，結果發現對4種染料的脫色情況各異，其中對染料番紅的脫色能力最強。2010年，呂聰[26]用MnP催化染料剛果紅降解脫色，最佳脫色條件如下：過氧化氫添加量為0.15 mmol/L，T=40℃，pH=5.5，用茯苓在液體發酵環境下得到的MnP來降解脫色染料結晶紫，最佳脫色條件為過氧化氫濃度0.15 mmol/L，T=40℃，pH=5.0。

5 木質素過氧化物酶(LiP)

木質素過氧化酶(Lignin peroxidase)是一種非生長的次生代謝產物。對木質素類具有很強的降解能力，利用優化的營養物質通過固定化能將其批量生產。經過純化后能氧化多種基質參加反應從而降解污染物，在工業三廢的處理、土壤修復等工作具中至關重要。

5.1 木質素過氧化物酶的結構

木質素過氧化物酶相對分子質量在36～45 kDa。純化后在40 kDa左右。最佳酶活性溫度在35～55℃之間，最佳pH范圍在2～5之間，氧化還原電位1.5 V[27]。

5.2 木質素過氧化物酶的催化機理

LiP是一系列含三價鐵離子、卟啉環和血紅素輔基的同工酶，可利用過氧化氫以及其他有機過氧化物催化一系列底物。LiP能把多電子單體氧化成自由基，同時從底物苯環奪取1個電子引發反應。化合物Ⅰ攜帶過氧化氫的2個氧化當量。其中一個是Fe4+-O中心，另一個則形成卟啉的陽離子自由基?；衔铫癜鸦|R氧化成陽離子自由基，經過后來連鎖的非酶反應得到產物。催化木質素側鏈的Cα-Cβ鏈使其斷裂將木質素降解[28]。見圖7。

圖7 木質素過氧化物酶的催化機理

5.3 木質素過氧化物酶催化聚合的應用進展

5.3.1 醫學領域

2010年，毛亮等[29]探討了LiP在不同環境中催化除去雌激素的效果，對反應物和產物的存在方式進行研究，對反應途徑加以跟蹤；同時分析了藜蘆醇、天然有機物對該反應的影響；考察了反應過程中酶活性的改變以及酶的失活原理、預防酶變性失活的方法。2012年，Wang等[30]利用從白腐真菌中分離得到的木質素過氧化物酶催化除去5類內分泌干擾物p-t-辛基酚、雌激素、雙酚A、17β-雌二醇、炔雌醇，去除效果非常明顯。

5.3.2 染料降解

2010年，Sushama[31]通過離子交換法從側孢芽孢桿菌將木質素過氧化物酶分離純化，并利用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳提高酶活性。隨后將其用于催化降解磺化偶氮染料甲基橙，取得了良好的降解效果。

5.3.3 環境保護

我國的畜牧業造成了嚴重的環境問題。2016年，Yan[32]利用木質素過氧化物酶對畜牧業產生的常見的8種污染物進行處理，結果對甲酚減少90%，吲哚化合物減少40%，氣味強度下降將近60%，揮發性脂肪酸減少大約40%。2015年，Lamia等[33]利用木質素過氧化物酶對橄欖加工之后產生的有色廢水進行脫色處理，同時對影響脫色效果的各種因素進行研究，將廢水中的酚類物質催化分解，降低廢水對環境的污染。

6 結語

過氧化物酶用于催化聚合的應用仍處于初級階段，且過氧化物酶資源有限，價格昂貴，對催化機理和一些影響因素的研究也尚未明確。由于過氧化物酶本身結構的特殊性以及對環境的友好性，目前，已被廣泛應用于醫藥、農業、工業、環境等各大領域。隨著研究人員的不懈努力下，問題會迎刃而解，過氧化物酶的用途會更加廣泛，過氧化物酶在催化聚合的應用前景更加誘人。

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Application of Peroxidase Catalytic Polymerization

ZHANG Li-hua,JIANG Jun-feng,TIAN Li-ping,LI Jiang
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi Datong University，Datong Shanxi,037009)

Peroxidase is one kind of enzyme,which can catalyze low molecular weight organic and inorganic substance’s polymer?ization to format the relative polymer.Peroxidase has better selectivity and catalytic efficiency than other enzyme,and it’s reaction con?dition is milder,therefore,it has been widely applied to scientific research,production and our daily life.This article summarized the research progress of five different kind of peroxidase’s structure,catalytic mechanism and application of catalytic polymerization.

peroxidase;catalytic polymerization;application

Q554+.6,X703

A

1674-0874(2016)05-0041-05

2016-05-25

張麗華(1981-)，女，山西大同人，碩士，實驗師，研究方向：生物酶。

〔責任編輯 楊德兵〕