CD40單克隆抗體枝聯(lián)聚乳酸體外擴(kuò)增樹(shù)突狀細(xì)胞的應(yīng)用

陳艷飛+顧春森+劉宏俠

【摘要】 目的 研究聚乳酸枝聯(lián)CD40單克隆抗體在樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）培養(yǎng)中的作用， 從而對(duì)三維立體培養(yǎng)有深入的認(rèn)識(shí)， 為體外擴(kuò)增樹(shù)突狀細(xì)胞提供新思路。方法 利用鼠抗人CD40單克隆抗體對(duì)DC的誘導(dǎo)效應(yīng)， 觀察聚乳酸枝聯(lián)CD40單克隆抗體誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量及生物學(xué)功能變化。結(jié)果 與對(duì)照組普通懸液培養(yǎng)體系樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量（5.43±33.31）×108比較， 實(shí)驗(yàn)組三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量（8.22±25.25）×108擴(kuò)增（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)在6、9 d促進(jìn)人樹(shù)突狀細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-12b（IL-12b）量高于對(duì)照組（P<0.05）。與對(duì)照組比較， 實(shí)驗(yàn)組更加能促進(jìn)人樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟， 促進(jìn)其表面共刺激分子表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論 通過(guò)CD40單克隆抗體與聚乳酸支架枝聯(lián)建立的三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)， 有利于樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增及其功能的增進(jìn)。

【關(guān)鍵詞】 CD40單克隆抗體；聚乳酸支架；三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)；樹(shù)突狀細(xì)胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.25.198

【Abstract】 Objective To research effect by polylactic acid scaffold combined with CD40 monoclonal antibody in dendritic cell （DC） culture， in order to get further knowledge of three-dimensional culture， and to provide new thoughts for dendritic cell expansion in vitro. Methods Dendritic cell count and changes of biological function in olylactic acid scaffold combined with CD40 monoclonal antibody induction were observed in accordance with inductive effect by mouse anti-human CD40 monoclonal antibody on DC. Results Comparing with （5.43±33.31）×108 of dendritic cell count in control group by common suspension culture system， experimental group had expansion of dendritic cell count as （8.22±25.25）×108 by three-dimensional culture system （P<0.05）. Experimental group had higher interleukin-12b （IL-12b） level in dendritic cell accelerated by three-dimensional culture system in 6 and 9 d than control group （P<0.05）. Comparing with control group， experimental group accelerated dendritic cell maturation and increased surface costimulatory molecules level. Conclusion Three-dimensional culture system established by combination of CD40 monoclonal antibody and bolylactic acid scaffold is helpful for dendritic cell expansion and function enhancement.

【Key words】 CD40 monoclonal antibody； Polylactic acid scaffold； Three-dimensional culture system； Dendritic cell

近年來(lái)， 組織工程方面的研究得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展， 聚乳酸由丙交酯開(kāi)環(huán)聚合制備， 具有無(wú)毒、可靠的生物安全性， 被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床， 是迄今研究最廣泛、應(yīng)用最多的可降解生物材料[1]。DC在外周血中含量極低， 在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[2]。因此人們?cè)噲D體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增出有功能的DC制備成疫苗， 達(dá)到治療疾病的目的[3]。在本文中， 作者通過(guò)CD40單克隆抗體與聚乳酸支架進(jìn)行枝聯(lián)探討三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增DC的應(yīng)用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 將需要擴(kuò)增的50份DC按培養(yǎng)皿隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組， 各25份。對(duì)照組采用普通懸液培養(yǎng)體系， 實(shí)驗(yàn)組采用三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外擴(kuò)增DC。

1. 2 儀器與試劑 電紡技術(shù)制備聚乳酸薄膜支架；CD40單克隆抗體5C11（蘇州大學(xué)）；GM-CSF、rmIL-4（美國(guó)R&D公司）；熒光抗體及同型對(duì)照抗體（美國(guó)Beioscineec公司）；BD FACSAria II流式細(xì)胞分選儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 DC的誘導(dǎo) 采集健康人外周血， 用密度梯度離心分離得到單個(gè)核細(xì)胞， 置于DC培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 2 h后去除非貼壁細(xì)胞， 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞中分為兩組， 對(duì)照組加入細(xì)胞因子GM-CSF、rmIL-4和5C11， 實(shí)驗(yàn)組加入GM-CSF、rmIL-4以及預(yù)先枝聯(lián)5C11的聚乳酸支架， 分別建立二維及三維培養(yǎng)系統(tǒng)， 每3天更換一次培養(yǎng)基， 8～10 d收集樹(shù)突狀細(xì)胞。

1. 3. 2 DC檢測(cè) ①流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表型及其計(jì)數(shù)。②利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-12b含量。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量的比較 與對(duì)照組普通懸液培養(yǎng)體系樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量（5.43±33.31）×108比較， 實(shí)驗(yàn)組三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量（8.22±25.25）×108擴(kuò)增， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 兩組樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12b比較 與對(duì)照組普通懸液培養(yǎng)體系比較， 實(shí)驗(yàn)組三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)在6、9 d促進(jìn)人樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12b量高于對(duì)照組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2. 3 兩組樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度和表面共刺激分子表達(dá)比較 與對(duì)照組普通懸液培養(yǎng)體系相比， 實(shí)驗(yàn)組三維立體培養(yǎng)系統(tǒng)更加能促進(jìn)人樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟， 促進(jìn)其表面共刺激分子表達(dá)水平上調(diào)。見(jiàn)圖1， 圖2。

3 討論

聚乳酸（PLA）為多個(gè)乳酸分子脫水縮合而成， 也稱為聚丙交酯。生產(chǎn)過(guò)程無(wú)污染， 產(chǎn)品可以生物降解， 是理想的綠色高分子材料。聚乳酸薄膜具有優(yōu)異的生物相容性、生物可降解性、良好的透氣性、透氧性及透二氧化碳性， 是唯一具有優(yōu)良抑菌及抗霉特性的生物可降解塑料。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞都是固著型的細(xì)胞， 如果不給其提供一個(gè)附著的基質(zhì)， 其就難以存活， 聚乳酸可提供支架作用， 其滿足組織工程材料的性能要求， 如無(wú)毒及組織相容性；高孔隙率且內(nèi)部聯(lián)通的三維結(jié)構(gòu)；可控生物降解性和生物吸收性等， 是良好的組織工程材料[4]。

CD40/CD40L是免疫應(yīng)答及其調(diào)控過(guò)程中重要共刺激信號(hào)， 為正常B淋巴細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、成熟提供重要的輔助信號(hào)， 促進(jìn)B細(xì)胞抗體分泌及其類(lèi)型轉(zhuǎn)換， 介導(dǎo)DC細(xì)胞的激發(fā)及分化成熟， 內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的改變， 炎癥因子的釋放等生理功能[5-7]。鑒于CD40分子廣泛的生物學(xué)效應(yīng)， 研制了多株功能性抗體， 如應(yīng)用于預(yù)防及治療多發(fā)性硬化癥的5D12、預(yù)防及治療同種異體移植排斥的Chi220以及用于治療腫瘤的多株單克隆抗體等。

綜上所述， 通過(guò)CD40單克隆抗體枝聯(lián)聚乳酸支架體外擴(kuò)增樹(shù)突狀細(xì)胞， 有利于DC數(shù)量的擴(kuò)增及其功能的增進(jìn)， 為體外大量擴(kuò)增DC提供了新思路。

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[收稿日期：2016-05-26]