基于GC-MS的心肌缺血大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物測(cè)定方法的建立△

徐文杰陳　穎

（1.廣東省第二中醫(yī)院

（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣州510095；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院廣州510520）

基于GC-MS的心肌缺血大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物測(cè)定方法的建立△

徐文杰1陳穎2*

（1.廣東省第二中醫(yī)院

（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣州510095；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院廣州510520）

目的：建立GC-MS測(cè)定心肌缺血大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物的方法。方法：皮下注射異丙腎上腺素復(fù)制大鼠心肌缺血模型，采用DB-5MS Ultra Inert（30m×250μm，0.25μm）色譜柱，GC-MS進(jìn)行程序升溫，氦氣（純度>99.999％）為載氣；無(wú)分流進(jìn)樣；流速為1mL·min-1；進(jìn)樣口溫度設(shè)為250℃；進(jìn)樣量為2μL。質(zhì)譜參數(shù)：離子源溫度設(shè)為230℃；電子能量為70eV；電子倍增器電壓1847V；電離方式EI。質(zhì)譜采用全掃描方式（掃描范圍30～550m/z）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。自建對(duì)照品物質(zhì)庫(kù)，并參考?xì)赓|(zhì)工作站的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)內(nèi)源性生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定指認(rèn)，然后進(jìn)行方法學(xué)考察，包括精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性。結(jié)果：儀器與方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)峰面積RSD值均小于20％。結(jié)論：該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于心肌缺血大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物的測(cè)定，該方法可應(yīng)用于心肌缺血模型的代謝組學(xué)研究。

大鼠 檢測(cè)方法 GC-MS 心肌缺血 代謝組學(xué)

近年來(lái)，氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）具有靈敏度好、費(fèi)用低、色譜性能較好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物代謝組學(xué)、微生物和臨床代謝組學(xué)研究[1]，加上其龐大化合物譜圖庫(kù)為鑒定工作帶來(lái)了很大的便利，能提供定量和定性的信息，在代謝組學(xué)研究中顯示出突出的優(yōu)勢(shì)。代謝組學(xué)研究的對(duì)象主要是動(dòng)物體液中的代謝物，如血液、尿液中的糖類，氨基酸，脂肪酸，甾體類物質(zhì)，胺類[2～3]，這些物質(zhì)的共同特征是極性強(qiáng)、揮發(fā)性低，所以往往不能直接進(jìn)樣分析，需進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理將其轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性衍生物，使其適用于氣相色譜進(jìn)行分離分析，此方法不僅可以擴(kuò)大氣相色譜的測(cè)定范圍，而且轉(zhuǎn)化成衍生物后，生物樣品中結(jié)構(gòu)極其近似的化合物更易被區(qū)分，同時(shí)還可解決載體、柱壁對(duì)高極性、低揮發(fā)性樣品的吸附問(wèn)題，改善樣品的峰形[4]。

本文采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，復(fù)制大鼠心肌缺血模型，建立大鼠血液中內(nèi)源性代謝物的測(cè)定方法，獲得每個(gè)峰的質(zhì)譜圖，通過(guò)每個(gè)峰代表的化合物的分子結(jié)構(gòu)碎片峰的類型和m/z，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。然后進(jìn)行方法學(xué)考察，并將其應(yīng)用于心肌缺血模型的代謝組學(xué)研究。

1　儀器與材料

1.1儀器：HP6890GC/5973MS型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（惠普公司，美國(guó)）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；JJ 3000型動(dòng)物電子天平（G&C公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（美國(guó)DENVER公司）；3K30型低溫高速離心機(jī)（sigma公司，德國(guó)）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SANYO MDF-382型超低溫冰箱（日本SANYO公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）。

1.2試藥：5-羥色胺、苯丙氨酸、蛋氨酸、庚二酸、丙酮酸、3-吲哚乙酸等均購(gòu)于阿拉丁試劑公司。鹽酸異丙腎上腺素注射液（ISO，規(guī)格：2mL：1mg，購(gòu)于西南藥業(yè)股份有限公司）。吡啶、無(wú)水硫酸鈉、氯甲酸乙酯（ECF）、氫氧化鈉、氯仿、無(wú)水乙醇、乙醇等均購(gòu)于成都化夏化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.3動(dòng)物：雄性Wistar大鼠，清潔級(jí)，體重180～220g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK粵2015-0015。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2015-0059。控制室內(nèi)溫度為（22±2）℃，相對(duì)濕度40％～50％，大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，于室內(nèi)保持12h光照、12h避光循環(huán)飼養(yǎng)。

2　方法與結(jié)果

2.1標(biāo)本采集與預(yù)處理：大鼠預(yù)先適應(yīng)2周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)方法[5]，大鼠每天皮下注射異丙腎上腺素（2mg·kg-1），連續(xù)10d，大鼠取樣前禁食12h，但可自由飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察大鼠行為學(xué)特征。d11早晨由眼眶采集全血250μL，置于含有EDTA-2Na的試管中，于4℃低溫離心機(jī)中13000rpm離心10min，取血漿置于含有EDTA-2Na的試管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于代謝組學(xué)的分析，測(cè)定血漿樣品中內(nèi)源性小分子代謝物。

2.2供試品溶液制備[6]：血漿于37℃水浴快速解凍，精密吸取100μL血漿于EP管中，添加400μL無(wú)水乙醇、100μL吡啶和50μL ECF，靜置1min，置XW-80A型旋渦混合器振蕩1min，加入300μL氯仿，繼續(xù)振蕩30s，靜置5min，置3K30型低溫高速離心機(jī)中3000rpm離心5min，取出后加入100μL 10mol·L-1NaOH，繼續(xù)加入50μL ECF，振蕩30s，3000rpm離心10min，吸去上層水層，往氯仿層添加少量無(wú)水硫酸鈉除去多余水分，吸取適量溶液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液，置4℃冰箱備用，待后續(xù)進(jìn)行GC/MS分析。

2.3GC-MS分析條件：色譜柱：DB-5MS Ultra Inert（30m× 250μm，0.25μm）；采用升溫程序模式：70℃（2.0min），70～300℃線性升溫（5℃·min-1），300℃（2.0min）；進(jìn)樣量為2μL；流速為1mL·min-1；無(wú)分流進(jìn)樣；載氣為氦氣（純度>99.999％）；進(jìn)樣口溫度設(shè)為250℃。質(zhì)譜參數(shù)：離子源溫度230℃；電離方式EI；電子能量70eV；電子倍增器電壓1847V。質(zhì)譜采用全掃描方式（掃描范圍30～550m/z）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。心肌缺血大鼠血漿GC/MS總離子流圖如圖1所示。

2.4代謝物的鑒定：自建對(duì)照品物質(zhì)庫(kù)及查詢網(wǎng)站（http：//metlin. scripps.edu/metabo_search_alt2.php和http：//www.hmdb.ca/），并運(yùn)用氣質(zhì)工作站的數(shù)據(jù)庫(kù)（WILEY 275.L及NIST05.L），對(duì)內(nèi)源性生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，選擇匹配度較高的內(nèi)源性生物標(biāo)志物作為鑒定結(jié)果。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度試驗(yàn)：取同一份血漿樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下GC/MS測(cè)定方法連續(xù)進(jìn)樣6次，選取若干豐度較大的代謝物為考察對(duì)象，計(jì)算相對(duì)峰面積（A）及考察一致性，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，考察的相對(duì)峰面積RSD值均小于20％，該方法精密度尚可。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2重復(fù)性試驗(yàn)：取同一份血漿樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下方法平行操作制備6份供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下GC/MS測(cè)定方法進(jìn)樣，選取若干豐度較大的代謝物為考察對(duì)象，計(jì)算相對(duì)峰面積（A）及考察一致性，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，考察的相對(duì)峰面積RSD值均小于15％，表明該制備方法可靠。

表2　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20、24h按照“2.3”項(xiàng)下GC/MS測(cè)定方法進(jìn)樣，選取若干豐度較大的代謝物為考察對(duì)象，計(jì)算相對(duì)峰面積（A）及考察一致性，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示考察的相對(duì)峰面積RSD值均小于15％，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

3.1動(dòng)物體液（如血液、尿液、組織液、唾沫等）中代謝物（如胺類、氨基酸、糖類、甾體類、脂肪酸類等物質(zhì)）是代謝組學(xué)研究的主要對(duì)象，體液中干擾分析的主要成分是蛋白質(zhì)[7]，其存在會(huì)對(duì)色譜柱和檢測(cè)器造成損害而且會(huì)增大檢測(cè)誤差。樣品提取是GS/MS代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，從體液中提取內(nèi)源性小分子代謝物具有一定困難。根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，去除蛋白質(zhì)的方法有甲醇（或乙腈）沉降法和離心沉降法，預(yù)試驗(yàn)時(shí)比較了兩種處理方法的效果，兩種處理方法的效果相差不多，一些特定物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不高，因此經(jīng)甲醇（或乙醇）處理的樣品在質(zhì)譜上得到的信息有所減少，故不采用此方法進(jìn)行蛋白質(zhì)去除。最終確定了以13000rpm對(duì)血樣進(jìn)行離心，這樣可以基本去除雜質(zhì)。采用此方法的前處理步驟較為簡(jiǎn)單，且不影響分析結(jié)果。

3.2生物樣本中代謝組種類和數(shù)量繁多，理化性質(zhì)懸殊，濃度差異巨大，動(dòng)物體液中的代謝物共同特征是極性強(qiáng)、揮發(fā)性低，兼顧不同性質(zhì)的化合物，因此提取方法要盡可能多地提取出生物樣本中的內(nèi)源性小分子代謝物，使樣品中完整的代謝物組分信息得以保留和體現(xiàn)。為了盡可能多地檢測(cè)到這些物質(zhì)，同時(shí)保持樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，本文選擇ECF為衍生化試劑，經(jīng)過(guò)一系列適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理，將這些極性強(qiáng)、揮發(fā)性低的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性衍生物，使生物樣品中結(jié)構(gòu)極其近似的化合物更易被區(qū)分。該衍生化試劑與酚、胺的衍生反應(yīng)可以在水相中進(jìn)行，衍生產(chǎn)物是碳酸酯和氨基甲酸酯，衍生產(chǎn)物色譜性能優(yōu)良。不需要將血液蒸干到無(wú)水狀態(tài)是該方法最大的優(yōu)點(diǎn)，大大降低了前處理的時(shí)間和難度。

3.3通過(guò)方法學(xué)研究，本文建立的基于GC/MS的代謝組學(xué)研究方法，重復(fù)性好、精密度高，適用于快速的高通量檢測(cè)。采用該方法對(duì)血樣溶液進(jìn)行測(cè)定，峰分離度、分辨率以及峰形都具有較好的結(jié)果。

[1]辜雪琴，范國(guó)榮，陸峰，等.氣相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)研究關(guān)鍵技術(shù)及典型應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2015，46（1）：68-73.

[2]Trethewey RN，Krotzky AJ，Willmitzer L.Metabolic profiling：a rosetta stone for genomics[J].Curr Opin Plant Biol.1999，2：83-85.

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[4]熊喜悅，盛小奇，王華，等.代謝組學(xué)氣相色譜-質(zhì)譜分析方法中樣品衍生化技術(shù)的新進(jìn)展[J].化學(xué)通報(bào)，2015，78（7）：602-607.

[5]Santo HC，Brenner G，Mayfield ED Jr.Studies on isoproteronol induced cardiomaegaly in rat[J].Am Heart J，1969，77：72-80.

[6]謝國(guó)祥.基于幾種色譜分析方法的生物樣本的代謝組學(xué)研究[D].上海：上海交通大學(xué)，2006：46.

[7]夏鑫華，劉梅，李歡.基于衍生化反應(yīng)和GC-MS技術(shù)測(cè)定大鼠血液和尿液中內(nèi)源性代謝物輪廓譜[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（1）：41-43.

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△基金課題：廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項(xiàng)目（No. 20152016）

Determination of endogenous metabolites in plasma of myocardial ischemia rat model by GC-MS

Xu Wenjie1Chen Ying2*（1.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital（Guangdong Province Engineering Technology Research InstituteofTraditionalChineseMedicine），GuangdongProvincialKeyLaboratoryofTraditionalChinese Medicine Research and Development，Guangdong Guangzhou，510095，China；2.Guangdong Food and Drug Vacational College，Guangdong Guangzhou，510520，China）

Objective：To establish a GS-MS method for determination of endogenous metabolites in plasma of myocardial ischemia rats. Methods：subcutaneous injection of isoproterenol replication model of myocardial ischemia rats，using DB-5MS Ultra Inert（30m×250m，0.25μm）column chromatography，GC-MS by temperature programmed，carrier gas was helium（purity>99.999％），the flow rate was 1mL·min-1;splitless injection;into the injector temperature of 250℃;sample injection volume was 2μL.MS parameters：ion source temperature was 230℃;EI ionization;electron energy of 70，electron multiplier voltage of 1847 V eV.MS scan mode wtih full data acquisition，and the scanning range of 30～550m/z.Using the database of temperament work station，combined with the self-built reference material library to identify endogenous biomarkers，select the endogenous biomarkers with high matching degree as the identification results.Results：Instrument and method precision，repeatability and stability test of relative peak area of RSD values were less than 20％.Conclusion：The method is rapid，sensitive，accurate，reproducible，and can be used for the determination of endogenous metabolites in plasma of rats with myocardial ischemia.The method can be applied to myocardial ischemia model of blood metabolic group study.

Rat Determining method GC-MS；myocardial ischemia model Metabonomics

R917

B

1672-8351（2016）10-0123-03