熊果酸減肥作用的研究△

趙晨潤夏煥春馬　曦

（1.北京第一零一中學北京100091；2.中國農業大學動物科技學院北京100193）

熊果酸減肥作用的研究△

趙晨潤1夏煥春1馬曦2*

（1.北京第一零一中學北京100091；2.中國農業大學動物科技學院北京100193）

研究表明熊果酸（UA）對脂肪代謝有一定的影響，但研究多數采用UA食物添加或灌胃方式進行，而實際應用中飲用方式更為方便。因此，本論文研究飲用UA對脂肪產生的影響，結果表明飲用UA后雌性小鼠體重及脂肪量顯著下降，雄性小鼠變化不顯著；利用體外培養前脂肪細胞系加入UA，發現其分化受到抑制，脂滴顯著減少。本論文首次發現飲用UA對雌性小鼠效果減肥優于雄性小鼠，為UA的生物功能開發及應用提供了有價值的實驗參考。

熊果酸 小鼠 前脂肪細胞系 脂肪產生

熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸，是廣泛存在于苦丁茶和山楂葉等天然植物中的一種化合物[1]。UA從天然植物中的提取工藝有很多的研究報道[2～5]，目前已有商品化的產品。研究表明熊果酸具有抗炎[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]及抗癌[9]等多種生物學效應。此外，研究表明UA對脂質代謝有重要作用。2007年，林科等通過UA灌胃高脂模型小鼠，發現UA可以有效降低膽固醇及甘油三酯指數[10]。2010年，張杰等利用UA對胰島素抵抗模型大鼠進行灌胃，發現UA能夠減少腹腔脂肪堆積[11]。2014年，日本的Markwick NP等發現蘋果皮中含有UA，并人工添加UA飼喂鱗翅類昆蟲的幼蟲，發現其體重顯著減輕[12]。2009年，劉志芳等研究表明UA能夠抑制胰脂肪酶的活性及構象[13]。2014年，單萍等研究發現熊果酸是一種胰脂肪酶抑制劑[14]。UA作為一種有潛在應用價值的植物活性成分，受到了科研工作者的關注。

目前大多以飼料添加或灌胃方式研究UA對脂肪的作用[10～12]，但在實際生活中UA以飲用方式來攝入更為方便。因此，本論文通過在飲用水中添加UA，探討其對小鼠體重、腹部脂肪及脂肪細胞的影響。

1　材料

1.1試驗動物：2月齡雌性及雄性Balb/c小鼠購于協和實驗動物研究所。30只雌性或雄性小鼠各隨機分為三組，每組10只：①正常飲水組，不添加UA；②飲用質量濃度為1μg·mL-1UA組；③飲用質量濃度為5μg·mL-1UA組。

1.2材料：高脂飼料購于北京科澳協力飼料有限公司，各組小鼠自由攝取高脂飼料。UA購于Sigma公司，純度≧98.5％，用礦泉水配制為1μg·mL-1及5μg·mL-1供小鼠飲用，每隔2d更換飲水。

2　方法

2.1記錄飲水量：每個水瓶均加100mL水，每隔2d換水時用量筒稱量水瓶中剩余的水，減少水量即為每3d小鼠的飲水量，記錄后進行統計分析。

2.2小鼠體重稱量：每隔2d用天平稱量小鼠的體重，記錄體重變化，進行統計分析。

2.3小鼠脂肪的稱量：飲用UA一個月后處死小鼠，用解剖鍵和鑷子打開腹腔，取出腹部脂肪置于培養皿中用天平進行稱量，記錄脂肪的質量。

2.4前脂肪細胞系3T3-L1的培養：前脂肪細胞系3T3-L1為美國菌種保藏中心產品，此細胞的維持、擴增及分化培養需用3種培養基。①維持培養基：90％DMEM培養基，10％胎牛血清，1.0μg/mL胰島素；②擴增培養需用前脂肪細胞擴增培養基：90％ DMEM培養基，10％小牛血清；③分化培養基：90％DMEM培養基，10％胎牛血清，1.0μM地塞米松；0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤；1.0μg/mL胰島素。3T3-L1脂肪細胞是貼壁生長，實驗在細胞培養室無菌條件下進行，細胞于37℃、5％CO2培養箱培養。

接種細胞到培養皿進行擴增，細胞長到細胞培養皿的70％前進行傳代。細胞長到培養皿的70％～80％時棄掉上清，加入相同體積的分化培養基培養，48h后棄掉上清，利用脂肪細胞維持培養基進行培養，每隔48h更換脂肪細胞維持培養基；細胞誘導后7～10d完全分化。加入分化培養基48h后，分別加入1μg·mL-1或5μg·mL-1UA進行培養，d7后進行觀察拍照。

2.5統計分析：采用一尾二型Student-t檢驗進行實驗組與對照組數據的顯著性差異分析。*表示P<0.05；**表示P<0.01。

3　結果與分析

3.1UA對小鼠飲水量及體重的影響：小鼠飲用UA后狀態良好，與正常飲水組小鼠比無明顯變化。雌性小鼠每3d飲用水量的結果如圖1所示，飲用1μg·mL-1的UA組小鼠的飲水量比對照組（P<0.01）及飲用5μg·mL-1的UA組（P<0.01）顯著增加。飲用5μg·mL-1的UA組小鼠的飲水量與對照組相比無顯著變化。雄性小鼠每3d飲用水量的結果如圖2所示，飲用1μg·mL-1的UA組及5μg·mL-1UA組小鼠與對照組相比均無顯著變化。以上結果表明雌性及雄性小鼠飲用UA的量有顯著不同，提示UA對雌性作用可能會更顯著。

有研究報道UA飼食糖尿病模型小鼠能顯著改善小鼠體重[15]。為了探討UA對小鼠體重的影響，每隔2d稱量小鼠體重進行統計分析。結果如圖3所示，飲用1μg·mL-1UA雌性小鼠18d后體重與對照組相比明顯下降（18d：P<0.05；21～30d：P< 0.01），飲用5μg·mL-1UA的雌性小鼠體重與對照組相比無明顯變化；飲用UA對雄性小鼠體重無明顯變化（圖3），表明質量濃度為1μg·mL-1的UA只對雌性小鼠體重減輕有顯著作用，對雄性小鼠無此作用。

3.2UA對小鼠脂肪產生的影響

有研究報道UA能夠降低細胞內脂肪酸合成酶的表達量及活性，進而影響脂肪的合成[15]。飲用UA1個月后處死小鼠，取出腹部脂肪利用天平進行稱量進行統計分析。結果如圖5所示，飲用質量濃度為1μg·mL-1UA雌性小鼠脂肪重量與其他兩組相比顯著下降（P<0.01）；飲用5μg·mL-1UA的雌性小鼠腹部脂肪與對照組相比顯著下降（P<0.01），表明飲用質量濃度為1μg· mL-1UA效果最好。雄性小鼠結果如圖6所示，只有飲用質量濃度為1μg·mL-1UA的小鼠腹部脂肪比對照組顯著減少（P< 0.05），與飲用5μg·mL-1UA組無差異。

3.3UA對前脂肪細胞系3T3-L1的影響：將未分化3T3-L1細胞加入24孔板進行培養，每組設3個重復空。未分化的前脂肪細胞系3T3-L1形態如圖5所示。細胞長到培養皿的70％～80％時棄上清加入分化培養基培養，48h后棄掉上清，利用維持培養基進行培養，每隔48h更換脂肪細胞維持培養基；細胞誘導后7～10d完全分化，可看到有脂滴形成（圖7）。

加入分化培養基48h后，加入1μg·mL-1或5μg·mL-1UA進行培養，d7后進行觀察拍照。結果如圖8所示，加入1μg·mL-1UA的脂肪細胞分化受到抑制，且形成大脂滴明顯少于其他兩組，而加入5μg·mL-1的UA的脂肪細胞組與對照組相比無顯著差異。以上結果表明1μg·mL-1的UA能夠抑制脂肪細胞分化，并減少脂肪細胞脂滴的形成。

4　討論

UA廣泛存在于多種天然植物中，研究表明具有抗炎、抗菌及降血糖等多種生物學效應[6～9]。此外，UA對動物體的脂肪代謝的影響已有報道。2003年，熊筱娟等發現UA能夠顯著降低急性肝損傷大鼠肝臟及血清中甘油三酯水平，促進肝糖原產生，并減輕肝細胞損傷[16]。2007年，林科等提取山楂中的UA制成納米級的乳濁液，灌胃小鼠14d后誘導高脂模型進行UA預防實驗；同時誘導高脂模型小鼠后UA灌胃進行治療。結果表明治療組和預防組均能一定程度降低高脂小鼠的膽固醇及甘油三酯的水平，且UA預防高脂小鼠的作用優于高脂小鼠的治療作用[10]。2010年，張杰等發現UA能夠減少胰島素抵抗模型大鼠腹腔脂肪堆積，提示灌胃方式攝入UA對腹腔內脂肪重量的增加有一定的抑制作用[11]。本論文結果表明雌性小鼠飲用1μg·mL-1或5μg·mL-1UA后均能顯著減少腹部脂肪堆積，且1μg·mL-1的UA飲用小鼠效果較好（圖5）；但雄性小鼠只有飲用1μg·mL-1的UA顯著減少腹部脂肪產生，而且5μg·mL-1的UA飲用小鼠腹部脂肪減少不明顯（圖6），此結果與張杰等[11]等利用雄性大鼠胰島素抵抗模型的結果一致。2014年，Markwick NP等人工添加UA飼喂鱗翅類昆蟲的幼蟲發現其體重顯著減輕[12]。本論文結果表明雌性小鼠飲用1μg·mL-1在18d后體重顯著減少，而5μg·mL-1的UA不能減輕體重（圖3）；同時無論是1μg·mL-1的UA還是5μg·mL-1UA對雄性小鼠體重無影響（圖4），此結果與Markwick NP等[12]結果一致，但本論文研究表明UA對雌性小鼠作用強于雄性小鼠，存在性別差異，但具體原因還需進行更多的研究。

UA對細胞水平的脂肪代謝有一定作用。2012年，樊慧錦等UA處理后，HepG2細胞的脂肪酸合成酶表達量及活性降低，且UA能誘導HepG2細胞的凋亡[17]。3T3-L1細胞是一種具有定向分化為成熟脂肪細胞的細胞系，能充分顯示脂肪細胞的特點，包括形態學改變、多種脂肪代謝酶的表達、廣泛的脂質積聚等，是體外研究脂肪細胞的理想實驗細胞模型。2012年，李迪等發現10、20μmol/L的UA處理后的3T3-L1脂肪細胞分化程度低于對照組和羅格列酮組[18]。本論文發現3T3-L1細胞體外添加不同濃度的UA，1μg·mL-1UA能顯著抑制3T3-L1細胞分化及脂滴的產生（圖8），而5μg·mL-1UA效果不明顯，此結果與李迪等的發現一致[18]。

以往的研究大多將UA加入飼料中或進行灌胃[11，12，15]，本論文將UA加入飲用水中讓小鼠自由攝取，飲用UA的小鼠表現正常，但飲用1μg·mL-1UA的雌性小鼠飲用量顯著高于對照組及飲用5μg·mL-1UA的雌性小鼠（圖1），但雄性小鼠飲用量無顯著差別，表明雌性小鼠飲用1μg·mL-1的UA對雌性小鼠的體重及脂肪減少作用顯著，提示UA對小鼠脂肪產生的作用有性別差異，但其原因尚不清楚。

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Effect of Ursolic Acid on Fat production

Zhao Chenrun1Xia Huanchun1Ma Xi2*（1.Beijing 101 high school，Beijing 100091，China；2.China Agricultural University College of animal science and technology，Beijing 100193，China）

Aim：Many studies have shown that ursolic Acid（UA）has many biological effects.Mostly studies focus on adding UAinto diet or gavage manner，but drinking UAis more convenient in real life.This study aimed at the effect of UAon losing fat.Method：The mice with high fat feedstuff was taken UAin drinking way，then the fat production was checked，and also the differentation and lipid droplets of preadipocytes cell line after UAtreatment.Results：The results showed body weights and abdominal fat from female mice drinking 1μg·mL-1UAwere significantly decreased compared with other groups.However，in female mice there was no difference of body weights.There were similar results in preadipocytes cell line treated with UA.The differentiation of preadipocytes cells was suppressed and the lipid droplets were reduced when cells were treated with 1μg·mL-1UA，but 5μg·mL-1UAtreatment had no effect on preadipocytes cells.Conclusion：In summary，right dosage of UAcould decrease fat production in female mice and cell line，but not in male mice.

Ursolic Acid Mice Preadipocytes cell line Fat production

R285

B

1672-8351（2016）10-0128-03

△國家自然科學基金（31272448）和中國科學技術協會青少年后備人才計劃資助。