蟲草素對高糖培養的恒河猴脈絡膜-視網膜血管內皮細胞血管新生的影響

朱小麗，孫小鳳，賴銘瑩

?

·實驗論著·

蟲草素對高糖培養的恒河猴脈絡膜-視網膜血管內皮細胞血管新生的影響

朱小麗*，孫小鳳*，賴銘瑩

?METHODS: Cultured RF/6A cells were divided into normal control group, high glucose group and high glucose (HG) + different concentration cordycepin groups (HG+10μg/mL group, HG+50μg/mL group, HG+100μg/mL group). The cell proliferation was assessed using cholecystokinin octapeptide dye after treated for 48h. The cell migration was investigated by a Transwell assay. The tube formation was measured on Matrigel. Furthermore, the impact of cordycepin on high glucose-induced activation of VEGF and VEGF receptor 2 (VEGFR-2) was tested by Western blot analysis.

?RESULTS: Compared with normal control group, cell viability markedly increased in high glucose group (P<0.05). Cordycepin inhibited RF/6A cell proliferation in a dose-dependent fashion: 10.2±0.9%, 23.4±1.5% and 31.1±1.2% inhibition as the concentrations of cordycepin were 10, 50 and 100μg/mL, respectively. The difference had statistically significant (P<0.05) compared with high glucose group. The number of cell migration were 55.6±2.70, 87.4±2.40, 65.4±2.7, 57.8±2.38, 62.4±2.77 in normal control group, high glucose group and HG+10μg/mL group, HG+50μg/mL group, HG+100μg/mL group respectively. Migration of RF/6A conspicuously increased in high glucose group(P<0.05) compared with normal control group; while showing a gradually reducing trend with the increase of cordycepin dose and a statistically significant difference compared with high glucose group(P<0.05). The number of tube formation were 18.7±2.08, 25.7±1.52, 19.9±1.57, 16.3± 2.51, 5.67±1.72 in the abovementioned group. Similarly showing a gradually reducing trend with the increase of cordycepin dose and a statistically significant difference with high glucose group (P<0.05). In addition, the number of tube formation of RF/6A in high glucose group significant increased compared with normal control group (P<0.05). The expression of VEGF and VEGFR-2 dramaticlly increased in high glucose groupvsnormal control group, oppositely gradually decreased with the increase of cordycepin concentrations, and had a statistically significant differencevshigh glucose group (P<0.05).

?CONCLUSION: Cordycepin can suppress the proliferation, migration and tubu formation of RF/6A in high glucose condition, might via inhibiting expression of VEGF and VEGFR-2.

目的：觀察蟲草素對高糖培養的恒河猴脈絡膜-視網膜血管內皮細胞(RF/6A)血管新生作用的影響，探討其可能的作用機制。

方法：培養RF/6A細胞，分為正常對照組(NC組)、高糖對照組(HG組)、高糖加不同濃度的蟲草素組(HG+10μg/mL組、HG+50μg/mL組、HG+100μg/mL組)。采用CCK8法檢測各組細胞的增殖活性；采用Transwell實驗檢測各組細胞的遷移；采用Matrigel檢測各組管腔形成的情況；采用Western-blot檢測各組細胞中VEGF和VEGFR2蛋白表達的情況。

結果：與NC組相比，HG組RF/6A的增殖活性增加(P<0.05)。不同濃度的蟲草素對RF/6A的增殖均有抑制作用，隨著蟲草素濃度增加，細胞活性下降。HG+10μg/mL組、HG+50μg/mL組、HG+100μg/mL組的增殖活性抑制率分別為(10.2±0.9)%、(23.4±1.5)%、(31.1±1.2)%，與HG組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。NC組、HG組、HG+10μg/mL組、HG+50μg/mL組、HG+100μg/mL組細胞遷移個數分別為55.6±2.70、87.4±2.40、65.4±2.7、57.8±2.38、62.4±2.77個。與NC組相比，HG組遷移細胞數量增加(P<0.05)；不同濃度蟲草素組細胞遷移數量隨著蟲草素濃度的增加而減少，與HG組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。NC組、HG組、HG+10μg/mL組、HG+50μg/mL組、HG+100μg/mL組的細胞管腔形成個數分別為18.7±2.08、25.7±1.52、19.9±1.57、16.3±2.51、5.7±1.72個。與NC組相比，HG組細胞管腔形成個數增加(P<0.05)；不同濃度蟲草素組細胞管腔形成個數隨著蟲草素濃度的增加而減少，與HG組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。與NC組相比，HG組VEGF和VEGFR2蛋白表達的量增加(P<0.05)；不同濃度蟲草素組中細胞內VEGF和VEGFR2蛋白表達的量均低于高糖對照組(P<0.05)。

結論：蟲草素可能通過抑制高糖下VEGF和VEGFR2蛋白的表達，抑制RF/6A細胞增殖、遷移和管腔形成，進而抑制血管新生。

蟲草素；高糖培養；恒河猴脈絡膜-視網膜血管內皮細胞；血管內皮生長因子；血管新生

引用：朱小麗，孫小鳳，賴銘瑩.蟲草素對高糖培養的恒河猴脈絡膜-視網膜血管內皮細胞血管新生的影響.國際眼科雜志2016;16(7):1237-1241

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見和嚴重的微血管并發癥之一。DR發病機制復雜，其中以血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)為主的促血管生長因子在眼部的過度表達是導致DR發生、發展的重要因素[1]。在DR病理過程中，高糖可導致視網膜血管內皮細胞過度分泌VEGF，引起血管內皮細胞損傷，血管滲透性增加，毛細血管閉塞，促進視網膜組織的缺血缺氧，最終引起新生血管的形成[2-3]。過度分泌的VEGF與其受體(主要是VEGFR2受體)結合磷酸化后，激活下游信號通路，誘導內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，導致新生血管形成增加[4]。蟲草素是冬蟲夏草中提取的單體，是蟲草制劑作用的核心成分，最早用于腫瘤的治療，近年來它的抗新生血管活性也逐漸受到關注。吉川紀子[5]于2005年通過體內實驗發現，蟲草素具有劑量依賴性抑制血管新生作用。蔡偉等[6]研究結果證明，蟲草素能抑制結腸癌細胞質中VEGF的表達。但蟲草素對VEGF和VEGFR2在血管內皮細胞上表達的影響還沒有報道。本研究擬將體外培養的RF/6A置于高糖環境下，觀察蟲草素對其增殖活性、遷移、管腔形成及VEGF和VEGFR2蛋白表達的影響，為蟲草素應用于DR提供實驗研究的支持。

1材料和方法

1.1材料RF/6A細胞(中科院上海細胞庫)；蟲草素(美國Sigma公司)；DMEM培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25%胰蛋白酶-ETDA消化液(美國Gibco)；青霉素、鏈霉素(Cyagen公司)；CCK8試劑盒(日本同仁公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；蘇木精染色液(上海碧云天生物科技公司)；Matrigel(美國BD公司)；兔抗人VEGF多克隆抗體(美國NovusBiologicals公司)；KDR多克隆抗體(德國Giobal Biotech公司)；山羊抗兔IgG HRP(美國Abcam公司)；細胞恒溫CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1 RF/6A細胞的培養采用含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的25mmol/L高糖DMEM培養液和5.5mmol/L正常DMEM培養液分別作為生長培養基。將RF/6A細胞接種到75cm2培養瓶內，制成密度為5×105/瓶的細胞懸液，置于恒溫37℃、體積分數5% CO2培養箱內培養，待細胞鋪滿瓶底后，用0.25%胰蛋白酶-ETDA消化，按1∶2或1∶3分瓶傳代，取生長良好的第3～4代細胞，用于下一步實驗。

1.2.2細胞分組將細胞分為5組，分別為NC組：5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培養下的正常對照組；HG組：25mmol/L高糖DMEM培養下的高糖對照組；HG+10μg/mL組：在高糖組中加入10μg/mL蟲草素；HG+50μg/mL組：在高糖組中加入50μg/mL蟲草素；HG+100μg/mL組：在高糖組中加入100μg/mL蟲草素。

1.2.3 CCK8檢測RF/6A細胞增殖活性取對數生長期RF/6A細胞用于實驗。按分組分別加入正常和高糖的DMEM培養液，制成細胞濃度為5×104個/mL的細胞懸液，每孔100μL，接種于96孔板上，每組6個復孔，共5組，邊緣孔均用無菌PBS填充，置于37℃、5% CO2培養箱內孵育。24h后將其中三組的高糖培養基吸干，分別加入含不同濃度蟲草素(10、50、100μg/mL)的高糖DMEM 100μL，各組培養48h后，吸去孔中的培養基，每天同一時間向每孔內加入含10%的CCK8(cell counting kit-8，CCK8)溶液的DMEM培養液100μL后放入恒溫37℃、5% CO2培養箱繼續培養2h，按操作說明用自動酶標儀測450nm波長下吸光度A值。相同條件下重復實驗3次。細胞活性抑制率(%)=[(實驗組平均A值-對照組平均A值)/對照組平均A值]×100%。

1.2.4 Transwell小室檢測RF/6A細胞移行Transwell小室置于含10% FBS的DMEM培養液600μL的24孔板中，正常組為5.5mmol/L葡糖糖的DMEM培養液，高糖組和蟲草素組為25mmol/L葡糖糖的DMEM培養液，接種RF/6A細胞于上室，密度為6×103/孔。每孔上室按不同分組加入含相應濃度蟲草素的無血清培養基100μL。37℃、5%CO2培養箱培養24h后，取出小室，棄去培養液，用棉簽輕輕擦掉小室上層未遷出的細胞，4%多聚甲醛固定小室20min,將小室適當風干后,0.1%結晶紫染色20min，PBS洗3次。細胞在400倍顯微鏡下隨機取5個視野照相，所得細胞數的平均值用以統計分析。每組3個復孔，重復實驗3次。

1.2.5 Matrigel檢測內皮細胞管腔形成在4℃下提前融化Matrigel。取96孔板，每孔內緩慢加入100μL液態Matrigel(所有操作均在冰上進行)。消化RF/6A細胞，用正常和高糖DMEM培養基分別稀釋為2×105個/mL細胞懸液。每孔加入50μL，設3個復孔，按不同分組每孔加入相應濃度的蟲草素。孵育12h后在顯微鏡下觀察，隨機取5個不同視野照相，對形成的完整管腔計數，取平均值。每組設3個復孔，重復實驗3次。

1.2.6 Western-Blot法檢測各組RF/6A細胞中VEGF和VEGFR2蛋白的表達六孔板正常和高糖DMEM培養液培養RF/6A細胞，蟲草素組每孔中加入不同濃度的蟲草素(10、50、100μg/mL)，高糖組和正常組不加蟲草素，藥物作用48h后，收集細胞。冰上超聲波粉碎儀粉碎細胞，12000r/min，4℃離心30min，收集、測定并調節上清蛋白濃度后，SDS-PAGE電泳(150V電壓)后轉移至PVDF膜，5% BSA室溫下封閉2h，VEGF及VEGFR2一抗(分別為1∶1000，1∶500)4℃下孵育過夜，TBST清洗3次，再以相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(均為1∶5000)37℃搖床孵育1h，TBST清洗3次。ECL顯影液顯色，用Bio-Rad凝膠成像系統成像后，圖片用Image J軟件分析條帶的信號強弱，以GAPDH為內參照，計算蛋白的相對表達量。

2結果

2.1蟲草素對RF/6A細胞增殖活性的影響CCK8結果顯示，與NC組比較，HG組RF/6A細胞增殖活性明顯提高，差異具有統計學意義(P<0.05)。蟲草素對RF/6A增殖有抑制作用，與HG組相比，HG+10μg/mL組、HG+50μg/mL組、HG+100μg/mL組細胞活性抑制率分別為(10.2±0.9)%、(23.4±1.5)%、(31.1±1.2)%。隨著蟲草素濃度的增加，細胞活性下降，與HG組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。各組間比較差異具有統計學意義(F組間=90.283，P<0.05，圖1)。

2.2蟲草素對RF/6A細胞遷移的影響Transwell實驗結果顯示，NC組、HG組、HG+10μg/mL組、HG+50μg/mL組、HG+100μg/mL組細胞遷移個數分別為55.6±2.70、87.4±2.40、65.4 ±2.7、57.8±2.38、62.4±2.77個，各組間比較差異具有統計學意義(F=185.651，P<0.05)。與NC組相比，HG組細胞遷移個數明顯增加(P<0.05)，與HG組相比，不同濃度蟲草素對RF/6A細胞的遷移均有抑制作用，且隨著蟲草素濃度的增加，移行細胞個數逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

2.3蟲草素對RF/6A細胞管腔形成的影響Matrigel實驗結果顯示，NC組、HG組、HG+10μg/mL組、HG+50μg/mL組、HG+100μg/mL組細胞的管腔形成個數分別為18.7±2.08、25.7±1.52、19.9±1.57、16.3±2.51、5.7±1.72個，各組間比較差異具有統計學意義(F=58.207，P<0.01)。與NC相比，HG組細胞管腔形成個數明顯增加(P<0.05)。與HG組相比，不同濃度蟲草素對RF/6A細胞的管腔形成均有抑制作用，且隨著蟲草素濃度的增加，管腔形成個數逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖1蟲草素對高糖下RF/6A細胞活性的抑制作用aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組。

2.4各組RF/6A細胞中VEGF和VEGFR2蛋白的表達Western-Blot實驗結果顯示,與NC組相比，HG組VEGF和VEGFR2蛋白表達相對增多(P<0.05)。與HG組相比，不同濃度蟲草素對RF/6A細胞VEGF和VEGFR2蛋白表達均有抑制作用(P<0.05)，隨著蟲草素濃度的提高，VEGF和VEGFR2蛋白表達的量下降。各組間比較差異具有統計學意義(F=217.074，P<0.01，圖4)。

3討論

DR是糖尿病最常見的眼部微血管并發癥，它已成為大多數發達國家工作年齡人群致盲的首要原因。高血糖被認為是DR的危險因素，且高血糖的嚴重程度和持續時間與DR患病率和嚴重程度直接相關[7]。長期慢性高血糖，機體血管滲透性紊亂，視網膜組織缺血缺氧，從而促進大量VEGF產生。VEGF被認為是眼內促新生血管生長因子中的最關鍵因子，在DR的發生發展中扮演非常重要的角色，參與了DR形成的各個環節[8]。血管的新生包括血管內皮基質降解、內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環和形成新的基底膜等步驟。抑制VEGF的產生及其受體的過度表達可以延緩DR病變的發生發展[9]，因此可以抑制VEGF表達的藥物有望成為糖尿病視網膜病變的有效治療藥物。

蟲草素是我國傳統中草藥中的滋補珍品，是從蛹蟲草中提取的一種核苷類抗生素，具有抗腫瘤、抗新生血管、抗白血病、抗菌、免疫調節、清除體內自由基、降血糖、降血脂等多種生物活性和藥理作用[10]。目前多用于抗腫瘤和腎病的治療，據報道蟲草素對糖尿病腎病的治療取得良好的療效，可通過下調TGF-β的表達抑制高糖誘導的大鼠腎小管上皮細胞轉分化的發生[11-12]。Yoo等[13]就冬蟲夏草水提取物(cordyceps militaris extract，CME)的抗新生血管及抗腫瘤作用做了有益的探討，結果發現不管在體內還是體外，蟲草素均能通過下調基質金屬蛋白酶MMP-2的表達，發揮抗新生血管和抗腫瘤的作用，而MMP-2對VEGF、VEGFR2蛋白的表達具有抑制作用。Won等[10]研究也證明了蟲草素具有抗炎及抗新生血管的活性。

圖2蟲草素對高糖下RF/6A細胞遷移的抑制作用(×400)A：NC組；B：HG組；C：HG+10μg/mL組；D：HG+50μg/mL組；E：HG+100μg/mL組；F：蟲草素對RF/6A細胞遷移抑制作用的條形圖(aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組)。

圖3蟲草素對高糖下RF/6A細胞管腔形成的抑制作用(×200)A：NC組；B：HG組；C：HG+10μg/mL組；D：HG+50μg/mL組；E：HG+100μg/mL組；F：蟲草素對RF/6A細胞遷移抑制作用的條形圖(aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組)。

本實驗依據相關的文獻[11,14-15]及預實驗的結果，選定了10、50、100μg/mL共3個質量濃度進行實驗，以證明蟲草素對體外高糖條件下RF/6A細胞血管新生的作用，并探討其可能的作用機制。結果發現，高糖條件下，不同濃度的蟲草素對RF/6A增殖、遷移、管腔形成均有抑制作用。而新生血管的生成包括細胞增殖、細胞遷移和管腔形成等過程，因此蟲草素在體外高糖環境下能夠抑制血管的新生。VEGF有兩種主要受體(VEGFR1和VEGFR2)，其中VEGFR2存在于血管和淋巴管內皮等處。在生理和病理血管新生中，VEGFR2均是主要的信號轉導蛋白，通過自身磷酸化觸發下游一系列信號通路，促進血管的發生。為進一步探討蟲草素抑制高糖下RF/6A 細胞血管新生的作用機制，本實驗采用Western-Blot的方法檢測VEGF和VEGFR2蛋白的表達。與正常組比較，高糖組中的VEGF和VEGFR2蛋白表達明顯增多，高糖促進了VEGF和VEGFR2蛋白的表達。不同濃度梯度的蟲草素均能下調高糖培養的血管內皮細胞VEGF和VEGFR2的表達，且隨著作用濃度的增加，蟲草素抑制血管內皮細胞VEGF和VEGFR2蛋白表達的作用增強。提示蟲草素可能通過改變VEGF和VEGFR2的表達，從而影響血管新生。因此蟲草素抑制細胞VEGF和VEGFR2表達可能是其抑制血管新生作用的一個重要機制。

圖4各組RF/6A細胞中VEGF和VEGFR2蛋白的表達A：各組RF/6A細胞中VEGF和VEGFR2蛋白電泳條帶；B：VEGF表達條形圖；C：VEGFR2表達條形圖(aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組)。

本實驗首次將蟲草素運用于眼科研究，從體外實驗著手初步探討了蟲草素對體外高糖培養的RF/6A細胞增殖、遷移、管腔形成和VEGF、VEGFR2蛋白表達的影響，為蟲草素用于體內實驗提供了一定參考，為臨床治療DR提供了新的思路。但蟲草素如何下調VEGF和VEGFR2蛋白表達的機制需要進一步研究證實。

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Anti-angiogenic mechanism of cordycepin on rhesus macaque choroid-retinal endothelial cell line cultured in high glucose condition

Xiao-Li Zhu*, Xiao-Feng Sun*, Ming-Ying Lai

s:Shenzhen Knowledge Innovation Program of Basic Research (No.JCYJ20130402145545766); Shenzhen Science and Technology Plan Project (No.201202144)

Ming-Ying Lai. Shenzhen Eye Hospital Affiliated to Jinan University, Shenzhen Key Laboratory of Ophthalmology, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China. laimydoc@163.com

2016-01-27Accepted：2016-06-14

?AIM: To investigate the angiogenesis effect and protective mechanism of cordycepin on rhesus macaque choroid-retinal endothelial (RF/6A) cell line cultured in high glucose condition.

Cordycepin; high glucose condition; rhesus macaque choroid-retinal endothelial (RF/6A) cell line; vascular endothelial growth factor; neovascularization

深圳市知識創新計劃基礎研究項目(No.JCYJ20130402145545766)；深圳市科技計劃項目(No.201202144)

(518000)中國廣東省深圳市，深圳市眼科醫院 暨南大學附屬深圳市眼科醫院 深圳眼科學重點實驗室

朱小麗，女，副主任護師，護士長，研究方向：眼科護理；孫小鳳，女，畢業于暨南大學，碩士，主治醫師，研究方向：眼底病。

賴銘瑩，畢業于中山大學眼科中心，博士，主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：青光眼、眼底病.laimydoc@163.com

2016-01-27

2016-06-14

Zhu XL, Sun XF, Lai MY.Anti-angiogenic mechanism of cordycepin on rhesus macaque choroid-retinal endothelial cell line cultured in high glucose condition.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(7):1237-1241

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.7.08

注：*朱小麗和孫小鳳對本文貢獻一致。

Shenzhen Eye Hospital Affiliated to Jinan University, Shenzhen Key Laboratory of Ophthalmology, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Co-first authors:*:Xiao-Li Zhu and Xiao-Feng Sun.