銀杏內酯B對高糖誘導人晶狀體上皮細胞凋亡的影響

王彥紅，蘭天野，陳　婷，劉　平，林麗麗

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·實驗研究·

銀杏內酯B對高糖誘導人晶狀體上皮細胞凋亡的影響

王彥紅，蘭天野，陳婷，劉平，林麗麗

?METHODS: The high glucose-induced HLEC model was established. Different concentrations of ginkgolide B were intervened. Cell viability was assayed by MTT assay, morphology of cell apoptosis was observed by hochest33258 staining. Cell ultrastructural changes were detected by transmission electron microscopy. Expressions of apoptosis-related factors caspses-3 and caspase-9 were tested by colorimetric detection.

?RESULTS: High glucose inhibited the activity of HLECs, induced apoptosis reaction of HLECs, caused high expression of apoptosis factors in cells; while ginkgolide B inhibited the decrease of cell viability induced by high glucose, decreased the HLEC apoptosis and reduced the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Caspase-9.

?CONCLUSION: Ginkgolide B may inhibit the expression of caspses-3 and caspase-9 then effectively inhibited high glucose-induced apoptosis in HLECs.

目的：探討銀杏內酯B對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLECs)凋亡的影響。

方法：建立高糖誘導的HLECs模型，用不同濃度的銀杏內酯B干預，MTT比色法檢測細胞存活率，Hochest33258染色觀察凋亡細胞形態，透射電鏡觀察細胞內超微結構變化，比色法檢測凋亡相關因子Caspase-3及Caspase-9的表達。

結果：高濃度葡萄糖可抑制HLECs活性，誘導HLECs發生凋亡，引起細胞內Caspase-3及Caspase-9表達水平升高；銀杏內酯B能明顯抑制高糖誘導的HLECs活力的下降，降低細胞凋亡率，減少高糖所致HLECs細胞內Caspase-3及Caspase-9的表達。

結論：銀杏內酯B可能通過抑制Caspase-3及Caspase-9的表達而有效抑制了高糖誘導的HLECs凋亡。

銀杏內酯B；高糖；晶狀體上皮細胞；凋亡

引用：王彥紅，蘭天野，陳婷，等.銀杏內酯B對高糖誘導人晶狀體上皮細胞凋亡的影響.國際眼科雜志2016;16(7):1242-1244

0引言

糖尿病是一種因體內胰島素分泌不足或相對缺乏而導致的一系列臨床綜合征。糖尿病慢性并發癥嚴重威脅人類健康，其中糖尿病性白內障已成為糖尿病并發癥中僅次于視網膜病變的第二大眼病[1]。銀杏內酯B(ginkgolide B，GB)為銀杏葉中的主要成分，是血小板活化因子和鈣通道拮抗劑，具有減輕栓塞及缺血所致的各類異常炎性反應的作用，已應用于治療心血管系統疾病[2-3]。有研究證實，銀杏內酯B可對實驗性糖尿病大鼠血管系統發揮保護作用[4]，在眼部，銀杏內酯B通過抑制視網膜神經節細胞凋亡促進其軸突生長，從而發揮視神經保護作用[5]，但是對傳代培養的HLECs影響的研究很少。本研究通過體外培養HLECs，觀察銀杏內酯B干預后高葡萄糖濃度下HLECs形態及生長情況的變化，探討銀杏內酯B對HLECs凋亡的抑制作用，為糖尿病性白內障的發病機制及防治提供新的途徑。

1材料和方法

1.1材料HLECs(ATCC公司)，銀杏內酯B(北京索來寶科技有限公司，純度>99%)，胎牛血清、DMEM培養基(美國Hyclone公司)，MTT試劑盒(上海伯奧生物制品公司)，Hoechst33258試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1 HLECs培養HLECs培養在含鏈霉素100μg/mL、青霉素100U/mL的DMEM培養基中，胎牛血清濃度為10%，培養箱內CO2體積分數為5%，溫度為37℃，細胞接種密度為5×105/mL，維持細胞生長密度為80%～90%，每3～5d傳代1次。

1.2.2實驗分組實驗共分4組：(1)陰性對照組：以正常培養液培養。(2)氧化損傷組：30mmol/L葡萄糖溶液作用12h。(3)銀杏內酯B組：加入銀杏內酯B作用24h之后，加入30mmol/L葡萄糖溶液作用12h，依銀杏內酯B濃度不同分為兩個亞組(1mol/L和10mol/L)。

1.2.3 MTT比色法檢測各組HLECs細胞活力細胞接種于96孔板中，接種密度為1×105/mL，培養24h后，向各孔細胞中加入20μL MTT(5g/L)，溫育4h，去除培養液后加入200μL DMSO溶液，室溫下振蕩10min后，用酶標儀測定各孔570nm的光密度值，細胞活力=(各組細胞光密度值/正常組細胞光密度值)×100%。

1.2.4透射電子顯微鏡觀察各組HLECs超微結構的變化4℃下用2.5%戊二醛溶液固定各組細胞24h，1%鋨酸后固定，PBS洗滌細胞2次，醋酸鈾快染，乙醇-丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋，切片機切片后用檸檬酸、醋酸鈾雙重染色，觀察細胞內結構改變。

1.2.5 Hochest33258染色觀察HLECs凋亡細胞形態細胞經相應處理后用PBS洗滌細胞2次，在150μL的Binding Buffer中加入2μL Hoechst染液，避光、室溫反應5min后置于熒光顯微鏡下觀察，正常細胞核表現為暗藍色，凋亡細胞的細胞核為亮藍色。

1.2.6比色法檢測各組HLECs中Caspase-3和Caspase-9的活性收集細胞并用1g/L胰酶消化，1200r/min離心10min，收集細胞并用PBS沖洗2次，每份樣品加30μL細胞裂解液，冰上孵育20min，10 000r/min離心10min，進行Caspase-3和Caspase-9活性檢測，檢測方法按Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒進行。Caspase活性=OD405nm/OD595nm。

2結果

2.1銀杏內酯B對各組HLECs活性的影響陰性對照組細胞活性為98.67%±3.44%，葡萄糖干預后細胞活性下降到32.67%±3.63%，與陰性對照組比較差異具有統計學意義(F=1.56，P<0.01)。用不同濃度銀杏內酯B處理后，HLECs活性分別提高到48.67%±3.32%和59.00%±3.57%，與氧化損傷組比較差異具有統計學意義(F=3.10、1.72，P<0.05，圖1)。

2.2各組HLECs超微結構的變化陰性對照組HLECs形態完整，核膜連續，核仁呈橢圓形(圖2A)；30mmol/L葡萄糖誘導的HLECs胞膜不清晰，細胞明顯膨脹，胞內線粒體出現空泡及變性，細胞核亦膨脹明顯(圖2B)；不同濃度的銀杏內酯B處理后，HLECs超微結構損害程度依次減輕，逐漸可看到細胞內細胞器結構，尤其是高劑量組作用明顯(圖2C～D)。

圖1MTT法檢測銀杏內酯B對高糖誘導的HLECs活力的影響aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組。

2.3銀杏內酯B對高糖誘導HLECs凋亡的影響Hoechst33258核染色法顯示，陰性對照組未見明顯凋亡染色的細胞核；氧化損傷組凋亡細胞明顯增多，細胞核熒光較強，呈致密濃染；給予不同濃度的銀杏內酯B作用后凋亡細胞減少，與氧化損傷組比較差異具有統計學意義(F=1.25、8.71，P<0.05)，且細胞核形態改善，熒光強度逐漸減弱(圖3、4)。

2.4銀杏內酯B對高糖誘導HLECs凋亡相關蛋白表達的影響由表1可知，HLECs經葡萄糖處理后，Caspase-3和Caspase-9的表達明顯增加，與陰性對照組比較差異具有顯著統計學意義(F=2.17、1.66，P<0.01)。給予不同濃度銀杏內酯B處理后，Caspase-3和Caspase-9表達量下降，與氧化損傷組比較差異具有統計學意義(F=2.54、1.73，P<0.05)。

3討論

抗氧化劑銀杏內酯B是一種天然抗氧化劑，在保護心肌、抗休克、改善腦缺血-再灌注、急性胰腺炎的救治方面發揮重要作用。國內外大量研究已經證實銀杏內酯B能減輕細胞凋亡與損傷，清除自由基、抗脂質過氧化，從而發揮對組織的保護作用[6-7]。李爽樂等[8]曾經報道過銀杏葉提取物通過增加Bcl-2蛋白表達，減少Bcl-2/Bax表達，阻止氧化損傷所致的SD大鼠晶狀體上皮細胞凋亡。但是關于銀杏內酯B對HLECs氧化損傷的保護作用鮮有報道。高糖是糖尿病性白內障患者晶狀體混濁的主要誘發因素。研究證實，高糖環境促使機體處于氧化應激狀態，機體的抗氧化防御系統被嚴重削弱，晶狀體受到氧化劑的攻擊，致使晶狀體蛋白質發生氧化損傷，最終發生晶狀體混濁[9]。本實驗中，細胞活力檢測結果顯示高糖處理的HLECs活力明顯降低，凋亡染色證實高糖明顯增加了HLECs凋亡數量；電鏡觀察細胞超微結構顯示，經高糖處理的細胞，其結構損傷明顯，但是經過銀杏內酯B預處理的細胞，其活力得到不同程度的改善，凋亡細胞數量減少，細胞形態逐漸改善，說明該藥物在一定程度上能夠抑制高糖誘導的細胞損傷，而且對細胞的保護作用呈劑量依賴性。

Caspase-3和Caspase-9是細胞凋亡通路的重要啟動者和參與者[10]。我們的研究結果顯示，30mmol/L葡萄糖作用HLECs后，兩種凋亡因子的表達量均明顯上升，而予以銀杏內酯B處理后，Caspase-3和Caspase-9表達減少，其下降趨勢與銀杏內酯B的劑量呈正相關，表明銀杏內酯B確實能抑制HLECs的凋亡，并且抗凋亡作用主要是通過抑制Caspase-3和Caspase-9激活實現的。

圖2透射電鏡觀察各組HLECs超微結構改變A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：1mol/L銀杏內酯B組；D：10mol/L銀杏內酯B組。

圖3銀杏內酯B對氧化損傷致HLECs凋亡的抑制作用(×200)A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：1mol/L銀杏內酯B組；D：10mol/L銀杏內酯B組。

圖4銀杏內酯B對氧化損傷致HLECs凋亡抑制率的影響bP<0.01vs氧化損傷組。

表1　銀杏內酯B對高糖致HLECs損傷Caspase-3和Caspase-9活性的影響，U/mL)

注：aP<0.05vs氧化損傷組；bP<0.01vs陰性對照組。

綜上所述，銀杏內酯B對高糖誘導的HLECs凋亡具有一定的抑制作用，抑制效應與藥物濃度有關，從而可能減少HLECs細胞凋亡及由此引起的病理損害。本研究結果提示了銀杏內酯B在白內障防治方面的運用潛力，為氧化應激相關晶狀體疾病的防治提供新的實驗證據。

1 Chu CJ, Johnston RL, Buscombe C,etal. Risk factors and incidence of macular edema after cataract surgery: a database study of 81984 Eyes.Ophthalmology2016；123(2):316-323

2 Zhang C, Tian X, Luo Y,etal. Ginkgolide B attenuates ethanol-induced neurotoxicity through regulating NADPH oxidases.Toxicology2011；287(1-3):124-130

3 Yang ZZ, Li J, Li SX,etal. Effect of ginkgolide B on striatal extracellular amino acids in middle cerebral artery occluded rats.JEthnopharmacol2011；136(1):117-122

4閔志雪,包鵬舉,崔鳳娟,等.銀杏內酯B對實驗性糖尿病血管病變的保護作用.醫學理論與實踐 2012；25(21):2616-2618

5王振宇，莫曉芬，蔣旭花，等.銀杏內酯B通過抑制視網膜神經節細胞凋亡促進其軸突生長.生理學報 2012；64(4):417-424

6 Nagahora N, Ito Y, Nagasawa T. Dietary Chinese quince polyphenols suppress generation of α-dicarbonyl compounds in diabetic KK-A(y) mice.JAgricFoodChem2013；61(27):6629-6635

7 Ji RL, Xia SH, Di Y,etal. Mechanism and dose-effect of Ginkgolide B on severe acute pancreatitis of rats.WorldJGastroenterol2011；17(17):2241-2247

8李爽樂，羅清禮，李正時，等.銀杏葉提取物對H2O2誘導的晶狀體上皮細胞Bcl-2和Bax表達的影響.國際眼科雜志 2006；6(4):786-788

9 Samanta A, Kumar P, Machhua S,etal. Incidence of cystoid macular oedema in diabetic patients after phacoemulsification and free radical link to its pathogenesis.BrJOphthalmol2014；98(9):1266-1272

10 Li X, Qi Z, Zhao L,etal. Astaxanthin reduces type 2 diabeticassociated cognitive decline in rats via activation of PI3K/Akt and attenuation of oxidative stress.MolMedRep2016；13(1):973-979

Effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell apoptosis

Yan-Hong Wang, Tian-Ye Lan, Ting Chen, Ping Liu, Li-Li Lin

National Natural Science Foundation of China (No.30973275)

Li-Li Lin. Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China. liuping3958@163.com

2016-03-09Accepted：2016-06-03

?AIM: To study the effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell (HLEC) apoptosis.

ginkgolide B; high glucose; lens epithelial cells; apoptosis

國家自然科學基金(No.30973275)

(150001)中國黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科

王彥紅，護師，研究方向：白內障。

林麗麗，碩士，主管護師，研究方向：白內障.liuping3958@163.com

2016-03-09

2016-06-03

Wang YH, Lan TY, Chen T,etal. Effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell apoptosis.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(7):1242-1244

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.7.09

Departmentof Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China