DEK 蛋白在結直腸癌組織中的表達及其與臨床病理的關系

粟連秀，張兆明，陸惠軍，韋翠容

（廣西醫科大學第八附屬醫院，廣西貴港537100）

DEK 蛋白在結直腸癌組織中的表達及其與臨床病理的關系

粟連秀，張兆明，陸惠軍，韋翠容

（廣西醫科大學第八附屬醫院，廣西貴港537100）

目的探討DEK蛋白在結直腸癌中的表達及其與臨床病理特征的關系。方法應用組織芯片和快捷免疫組織化學MaxVisionTM法檢測185例結直腸癌及癌旁正常黏膜組織中DEK蛋白表達情況。結果DEK蛋白在結直腸癌中的表達陽性率為86.49%（160/185），明顯高于正常結腸黏膜組織［64.86%（120/185）］，差異有統計學意義（P＜0.001）。DEK蛋白表達與腫瘤臨床分期及浸潤深度有關，臨床分期越晚、腫瘤浸潤越深，DEK蛋白表達越高，且差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論DEK蛋白在結直腸癌的發生、發展中起著重要作用。

結直腸腫瘤；免疫組織化學；DEK；組織芯片

結直腸癌是消化系統疾病中常見的惡性腫瘤之一。由于全球人口老齡化及物質生活水平不斷改善，結直腸癌發病率及死亡率在全球呈不斷上升趨勢，已列入常見十大惡性腫瘤之一。隨著分子生物學的快速發展及對腫瘤發病機制研究的不斷深入，逐漸認識到結直腸癌的發生、發展與多種因素有關，腫瘤相關基因與腫瘤的關系逐漸被闡明。DEK蛋白是原癌蛋白的一種，很多種惡性腫瘤和一部分自身免疫性疾病的發生、發展均與DEK蛋白存在有關，另外，DEK蛋白的功能還有抑制細胞衰老、凋亡，影響細胞增殖和分化。本研究選擇組織芯片聯合免疫組織化學MaxVisionTM的方法對結直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織進行檢測，分析DEK蛋白表達水平，通過檢測結直腸癌中DEK蛋白表達情況，探討DEK蛋白表達與結直腸癌發生、發展及各臨床病理特征的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取本院2010年1月至2012年10月收治的結直腸癌患者185例，均行手術切除。其中男99例，女86例；年齡28～89歲，平均（58.36±1.34）歲；結腸癌101例，直腸癌84例；按照美國癌癥聯合會（AJCC）公布的標準分期：Ⅰ期47例，Ⅱ期61例，Ⅲ期67例，Ⅳ期10例；腫瘤分化程度：高分化腺癌43例，中分化腺癌88例，低分化腺癌54例；伴淋巴結轉移71例，無淋巴結轉移114例。185例患者均經病理檢查確診，術前均未曾行放、化療。185例結直腸癌組織作為研究對象；同時選擇距腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁正常黏膜組織作為對照。

1.2試劑英國Abcam公司生產的兔多克隆抗體DEK（ab85407）、福州邁新生物技術公司生產的抗體稀釋液、即用型快捷免疫組織化學MaxVisionTM試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑等。

1.3方法

1.3.1組織芯片制備組織芯片采用自制的方法。

1.3.1.1空白受體蠟塊制作空白受體蠟塊數張備用。

1.3.1.2制備組織芯片蠟塊（1）標記目標組織，組織芯片的供體蠟塊先行常規病理切片，并經常規蘇木精-伊紅（HE）染色，病理診斷閱片，然后根據組織切片結果，對相應供體蠟塊進行目標組織標記；（2）對組織芯片蠟芯的取樣，預熱蠟塊使其軟化，用穿刺針對目標組織進行抽取，將抽取的目標組織分別按預先指定位置放進空白受體蠟塊模中；（3）組織芯片蠟塊行二次包埋，在蠟模成型框上放入已經取樣組織芯片蠟塊，把熔化的石蠟液倒入包埋盒，室溫冷卻至石蠟凝固；（4）把蠟模成型框和塑料石蠟包埋盒周圍殘留的石蠟去除，并將成型組織芯片蠟塊取出。

1.3.1.3組織芯片切片采用全自動組織切片機進行常規病理切片，制備石蠟組織芯片切片，各切片厚度約4 μm。

1.3.2免疫組織化學染色選用快捷免疫組織化學MaxVisionTM法進行免疫組織化學染色。嚴格按照產品說明書的要求操作，具體染色步驟：（1）先將石蠟組織芯片切片行脫蠟和水化，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.4）沖洗，每次3 min，共3次；（2）高溫、高壓抗原修復；（3）使用3%過氧化氫溶液（H2O2）在室溫下孵育10min，使內源性過氧化物酶的活性被阻斷；給予PBS沖洗，每次3min，共3次，去除PBS液；（4）將DEK一抗工作液（1∶800）分別滴入切片，置于4℃冰箱中過夜；（5）用PBS沖洗，每次5 min，共3次，去除PBS液；各張切片加入即用型快捷免疫組織化學MaxVisionTM試劑，繼續室溫孵育15 min；PBS沖洗，每次3 min，共3次；（6）去除PBS液，每張切片滴加新鮮配制的DAB溶液，在顯微鏡下連續觀察5min；（7）使用流動自來水沖洗，HE復染，用自來水沖洗后返藍，梯度乙醇脫水使其干燥，再用中性樹膠封固；選用已知DEK陽性的組織切片作為陽性對照，而以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4結果判斷標準DEK蛋白免疫染色陽性物質呈棕黃色顆粒，細胞核著色；染色評分方法：根據切片中染色強度深淺程度和陽性表達的細胞數比例情況，按照Mathew等［1］的分級標準：切片中無表達為（-）；切片中著色細胞數小于50%或切片中染色較淺為（+）；切片中著色細胞數大于50%且染色較深為（++）。其中（+）和（++）均視為表達陽性。

1.5統計學處理應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1DEK蛋白在癌旁正常黏膜組織與結直腸癌組織中的表達情況DEK蛋白在癌旁正常黏膜組織和結直腸癌組織中的表達陽性率分別為64.86%（120/185）、86.49%（160/185），且二者比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。見表1，圖1、2。

表1　DEK蛋白在癌旁正常黏膜組織及結直腸癌組織中的表達情況

圖1　DEK蛋白在正常腸黏膜組織中陰性表達情況（快捷免疫組織化學MaxVisionTM法，200×）

圖2　DEK蛋白在結直腸癌組織中強陽性表達情況（快捷免疫組織化學MaxVisionTM法，200×）

2.2DEK蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

DEK蛋白在結直腸癌組織中表達與患者性別、年齡、分化程度等無關（P＞0.05），與腫瘤組織浸潤深度、臨床分期有關（P＜0.05）。見表2。

表2　DEK蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系（n=185）

續表2　DEK蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系（n）

3　討論

組織芯片技術是在一張固相載體上，集中數十個至數千個不同個體組織標本，形成組織微陣列［2］。組織芯片技術優點是可以進行大樣本檢測，從而節省時間、人力，還可節省試劑及組織標本等，在當今醫學研究領域中得到了廣泛應用。

DEK蛋白是一種可磷酸化的具有染色質架構蛋白，其由375個氨基酸組成，屬于原癌基因；DEK蛋白主要位于細胞核內。于多細胞生物體中及除酵母外的一些單核細胞有機體中，普遍存在DEK蛋白。DEK在DNA有2個結合域，二者結合特性不同，對CK2磷酸化反應能力也不同［3］。DEK蛋白的生物學作用主要是通過干擾細胞分裂、影響DNA修復［4］，具有抑制細胞分化、衰老及凋亡等作用［5-7］。在多種惡性腫瘤中，DEK蛋白過度表達。喬煒等［8］研究發現，在正常胃組織、慢性萎縮性胃炎組織及胃癌組織中，DEK蛋白表達陽性率不同，分別為28.6%（14/49）、60.3%（38/63）、78.0%（103/132），三者兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；同時腫瘤分化程度及有無淋巴結轉移均會影響DEK蛋白在胃癌組織中的表達，表明在胃癌的發生、發展中，DEK蛋白起著重要的促進作用。Lee等［9］研究還發現，DEK蛋白對宮頸癌細胞凋亡具有拮抗功能，在轉錄調節及和HAT相關的凋亡過程中均起作用，并且DEK蛋白還是高危型HPVE7基因調控下的主要下游靶基因，因此推測HPVE7基因表達因受DEK蛋白的影響，從而引起宮頸癌的發生。張坤等［10］研究結果顯示，DEK蛋白在結直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.01）；同時運用Log-rank及Cox風險回歸模型，通過結直腸癌患者生存時間與DEK蛋白表達的相關性分析，以及DEK蛋白表達對患者生存因素的影響發現，在結直腸癌患者中DEK蛋白高表達者總生存時間明顯低于DEK蛋

Relationship between DEK protein expression in colorectal cancer tissue and clinicopathology

Su Lianxiu，Zhang Zhaoming，Lu Huijun，Wei Cuirong（Eighth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Guigang，Guangxi 537100，China）

ObjectiveTo investigate the expression of DEK protein in colorectal cancer and its relationships with clinicopathological features.MethodsThe expression of DEK protein was detected in 185 cases of colorectal cancer tissues and paracancerous normal mucosa tissues by using the tissue microarray and immunohistochemical MaxVisionTM method.Results The positive expression rate of DEK protein in colorectal cancer was 86.49%（160/185），which was significantly higher than 64.86%（120/185）in the normal colonic mucosa tissues，the difference was statistically significant（P＜0.001）.The DEK protein expression was related to the tumor clinical stage and infiltration degree.The later the tumor clinical stage，the deeper the tumor infiltration，the higher the DEK protein expression，the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionDEK protein plays an important role in the occurrence and development of colorectal cancer.

Colorectal tomur；Immunohistochemistry；DEK；Tissue microarray

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.19.005

A

1009-5519（2016）19-2951-03

粟連秀（1970-），在職碩士研究生，副主任醫師，主要從事胃腸腫瘤病理的研究。