原子力顯微鏡特點及其在食品中的研究進展

李芳菲，夏秀芳，孔保華

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

原子力顯微鏡特點及其在食品中的研究進展

李芳菲，夏秀芳，孔保華*

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

原子力顯微鏡具有高的空間分辨率、操作過程簡單快捷，是一種應用廣泛的顯微分析儀器。原子力顯微鏡能夠在非大氣環境下進行試驗，可以廣泛應用于物理、化學、生物材料、食品、電子學等領域。介紹原子力顯微鏡的工作原理、功能特點及作用模式，并綜述了其在食品科學研究領域中的研究進展。

原子力顯微鏡；原理；功能特點；模式；研究進展

隨著人們對微觀世界的不斷探索，很多普通光學顯微鏡無法觀察到的物質內部微觀結構逐漸成為人們關注和研究的熱點，而普通分子技術的局限性也日益突出。20世紀80年代中期由Binning等在掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunnel Microscope，STM）基礎上發展起來一種更加精密的顯微工具，原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）［1-2］。原子力顯微鏡主要是通過原子級的探針對樣品表面進行“掃描”，二者間的相互作用使裝配探針的微懸臂發生輕微形變，通過檢測微懸臂的形變程度，便可以得到樣品表面與探針之間的相互作用力大小；在探針沿樣品表面進行掃描時，保持尖端與表面原子力恒定所需施加于壓電材料兩端的電壓波形［3］，就能得到待測物質表面總電子密度的形貌，從而彌補掃描隧道顯微鏡無法觀測非導電樣品的缺憾［4］。原子力顯微鏡使用方便、操作簡單，已應用在生物材料、化工工業、食品等多個不同領域。本文將從原子力顯微鏡的原理出發，簡述其功能特點和模式，并綜述其在食品科學研究中不同產品和不同組分中的研究進展。

1　原子力顯微鏡

1.1原子力顯微鏡及其成像原理

作為最新的顯微檢測儀器，AFM是對人類視覺感官功能的有力延伸和增強，與普通光學顯微鏡相比，AFM的成像效果更加全面和先進。AFM的一端是固定的，另一端是裝有納米級尖銳微小針尖的彈性微懸臂，當探針在樣品表面掃描時，探針針尖與樣品表面產生相互作用力，該作用力會使微懸臂產生形變［5］，由激光束發出的激光會直射到微懸臂的背面，微懸臂將激光發射到光電檢測器上，使之轉換為電信號輸入計算機，即使是小于0.01 nm形變也可以在光電檢測器上顯示出大約10 nm的位移，經處理獲得樣品的表面特征信息（如圖1）［6］。近年來為了更加詳細深入的了解樣品納米級信息，由輕敲模式又發展出相位成像模式，這種成像方式是通過檢測驅動微懸臂探針振動的信號源的相位角與實際微懸臂探針振動的相位角之差（即兩者的相移）的變化來成像，這種方式得到的樣品表面信息更加豐富準確［7］。

圖1　原子力顯微鏡原理圖Fig.1The principle diagram of the atomic force microscope

1.2原子力顯微鏡的功能及特點

用肉眼看到的自然界中物質大多數是平整光滑的，實際上物質表面都存在我們無法直接觀察到的、及其微小的孔隙和顆粒狀結構。AFM就是通過探針和樣品表面之間的作用力，使微懸臂產生形變，由此將二者之間的相互作用力以力-距離曲線的形式展示出來，再對曲線進行分析，并且將分析后得到的樣品形貌特征通過圖像的方式清晰的展示出來。從樣品的宏觀上來說，AFM可以檢測樣品表面的粗糙程度、孔隙結構、顆粒度等，有助于我們了解物質的表面物化屬性；除了對物體表面的觀察外，AFM還能夠得到該物質的晶體結構、分子聚集狀態等一系列的信息［1］，有助于我們了解物質的理化性征；此外，我們還可以利用探針與分子的結合程度來了解分子的拉伸彈性、空間結構等，有助于我們更好的了解分子屬性。

AFM是通過檢測樣品-探針間的相互作用力來完成高分辨率成像的。原子力顯微鏡特殊的作用方式具有以下4方面的優勢：1）檢測樣品的材質廣泛，導體、半導體、瓷器、金屬甚至是生物細胞等都可以作為檢測對象［1］；2）制樣簡單不繁瑣，甚至無需處理，只需對樣品進行簡單固定即可，省去了切片、脫水、染色、制片等復雜程序，不僅對樣品破壞性小，而且節省檢測時間；3）適應于各種工作環境，包括液體、空氣和真空甚至是生理條件下直接成像，而且還可以對活體細胞進行實時動態觀察；不論是常溫還是低溫等條件，AFM都能夠正常工作，有助于使樣品保持最佳狀態；4）能提供生物分子和生物表面納米級分辨率的三維圖像，還有局部的電荷密度和物理特性等精密細節［8］，在這一點上它明顯優于普通光學顯微鏡，這將有助于人類更細致的探究未來世界。

1.3原子力顯微鏡作用模式

AFM是一種具有原子級的高分辨率的顯微工具，它是通過控制并檢測樣品－針尖之間的相互作用力完成成像的［9］，當探針與樣品之間的工作距離不同時，原子力顯微鏡的工作狀態也不同，由此可將原子力顯微鏡的作用方式分為3種：接觸模式、非接觸模式以及間歇接觸模式。

1.3.1接觸模式

接觸模式又稱為DC模式，主要通過探針與樣品表面始終接觸產生的作用力使懸臂發生形變［2］，其中包括恒力和恒高兩種模式。在三維空間體系中，保持微懸臂的偏轉程度不變，即探針和樣品之間的作用力恒定，當沿x、y方向掃描時，記錄z方向上掃描器的情況從而得到樣品表面形貌特征，這種模式稱為恒力模式，該模式適用于物質的表面分析；恒高模式指樣品和針尖的相對高度不變，通過微懸臂的偏轉程度來反映樣品表面形態，由于這種模式對樣品的高度比較敏感，能夠快速掃描樣品，因此適用于分子、原子的圖像觀察。接觸模式主要就是依靠探針和樣品之間的斥力得到相對穩定、分辨率高的圖像，但是由于探針和樣品接觸頻繁，因此容易使探針變型，同時對樣品也會有不同程度的損傷［10］。

1.3.2非接觸模式

非接觸模式又稱為AC模式［2］，該模式下探針與樣品表面始終存在一定的距離，大約5 cm～20 cm，并且探針和樣品間是通過保持微懸臂共振頻率或振動幅度控制的，因此AC模式對待測樣品破壞或移動的可能性較小，適用于疏水性液體表面等，并且該模式靈敏度較接高，但弊端就是分辨率較低，工作效率低［10］。

1.3.3輕敲模式

一般而言，大多數生物樣品更適合第三種模式“輕敲模式”，是AFM中最常用的一種模式，該模式下探針處于振動狀態，在垂直方向上敲擊樣品表面，從而獲得樣品表面的形貌特征，與樣品表面間斷接觸的過程中摩擦力和剪切力對樣品的影響相對較小，這樣既能保證高的分辨率，又能將接觸對探針和樣品的破壞降到最低，所以這種方法適合柔軟細致以及粘性較大的樣品［11-12］。一般輕敲模式要優于非接觸模式，尤其是作用于樣品表面較大范圍的掃描成像，而且該模式還可以在液體環境下使用［13］。

2　原子力顯微鏡在食品科學中的研究進展

2.1AFM在不同類型食品中的應用

2.1.1肉及肉制品

隨著科技的發展，人們的生活水平不斷提高，在維持溫飽的基礎上，人們對于食品的品質也有更高的要求，尤其對肉品品質的要求也越來越高。肉的嫩度是衡量肉品品質極非常重要的指標之一。因此，人們對肉的嫩度越來越重視，對肉的嫩度的研究也越來越深入。

肉的嫩度是指肉入口咀嚼時所感覺的印象，包括入口時是否易被咬開、咀嚼難易程度以及在口中的殘留量，肉越嫩就越容易咀嚼，反之肉質越老［14］。肌肉的嫩度與肌肉蛋白分子之間的相互作用力、結締組織的分布情況以及脂肪含量息息相關，通過調節pH、添加胰蛋白酶等方法都可以改變肉的嫩度［15］，考察嫩度常用指標是剪切力值和肌原纖維小片化指數，除了常規測定剪切力的方法，我們還可以用原子力顯微鏡進行觀察。李林強等［16］分別將牛肉用濃度為100、150、200 mmol/L的CaCl2處理，于4℃真空包裝儲藏72 h，用AFM觀察肌原纖維小片，準確的得出了肉嫩化程度的結果；周芳等［17］用AFM對肌原纖維進行掃描，發現不同濃度Ca2+處理的牛肉嫩度一定會有改善，并且隨著Ca2+濃度的增加肌原纖維降解增多，說明肉的嫩度越大。利用AFM對肉的嫩度的測定，不僅比普通測定方法更加方便，而且是對剪切力和肌原纖維小片化指數形態學上的完善，有助于我們進一步研究有關于改善肉嫩度的方法。

2.1.2乳及乳制品

乳是一種復雜的膠體體系，膠體體系的穩定性是食品質量加工的重要性質，利用AFM能夠更準確的對體系表面作用力相關信息進行研究。Kirby等［18］通過AFM對牛血清蛋白和酪蛋白在十二烷烴/水、空氣/水界面膜圖像結構，AFM圖像能夠觀測到兩種體系中不同的網狀結構，結果顯示圓狀球體結構是單個牛血清蛋白分子，界面膜的二維網狀結構是由獨立的蛋白質分子組成的。因此利用原子力顯微鏡能夠系統全面的了解乳膠體的表面信息以及膠體結構等。王麗娜等［19］以水牛奶酪蛋白、乳牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白為原料，利用激光粒度分析儀和原子力顯微鏡研究三者蛋白粒徑分布情況以及zeta電位及表面顆粒形態上的差異，結果發現三種蛋白均呈現球行或橢球形，其中水牛奶酪顆粒分布較均勻，而另外兩種乳源蛋白顆粒有明顯的聚集行為，并綜合本試驗中的其他結果得出牛乳蛋白氨基酸穩定性較羊乳蛋白穩定性強，為后來研究乳品蛋白功能特性等提供理論基礎。

2.1.3糧食作物

Wang等［20］在研究氯乙酸和油酸對玉米蛋白自組裝結構的影響以及類胡蘿卜素的含量對玉米蛋白質結構的影響時，利用AFM對吸附于親水和疏水表面的玉米蛋白層表面形貌進行觀察，結果顯示其親水性表面的粗糙程度比環形結構大，而疏水表面的玉米蛋白膜沒有明顯的特征，由此得出類胡蘿卜素以及氯乙酸和油酸對玉米蛋白表面形貌的影響。張良等［21］在空氣中利用AFM的輕敲模式在新解離的云母片上獲取不同類型白酒的納米級成像，盡管針尖接觸白酒可能對成像造成一些影響，但是通過研究成像效果較好的圖像可以看出，不同類型的白酒所含顆粒的形狀有球形、錐形和扁平狀等不同形狀，而且由于生產工藝、氣候等因素的影響使顆粒的分布和大小也有區別，由此構成不同香型白酒特殊的納米圖譜，實現了在納米水平上對白酒香型的研究。

2.2AFM在研究不同食品組分中的應用

對食品組分的研究往往要從微觀角度探究其結構特性，從而理解其宏觀狀態下的性質。多糖、蛋白質和脂質作為食品中的重要組分，不僅具有重要的營養價值，對食品品質的形成也具有不可或缺的作用。

2.2.1多糖類

多糖物質是許多食用膠等作為食品加工中的增稠劑和穩定劑，對食品的組織結構和特性有著非常重要的作用。多糖含有多條支鏈，分子的均一性和線性比DNA和蛋白質差一些，因此在空氣中成像的分辨率較低，而利用原子力顯微鏡能夠很好的解決這個問題。

卡拉膠具有連續的連結結構，通過分子雙螺旋結構以及離子作用使分子末端與中間相連接，在干燥的空氣中容易形成薄膜結構，Morris等［22］利用AFM觀察卡拉膠發現其呈現纖維網狀結構，該結構在Gunning等［23］的研究中同樣得到證實；Kirby等［24-25］利用AFM的輕巧模式觀察沉積在云母片中的黃原膠結構時，從圖像中可以看出其分子間相互纏繞，每個網點寬為1.6cm，高約為3.3 cm，與掃描方向垂直的方向上有10 nm厚的分子帶，比文獻中記載的黃原膠的螺旋尺寸略大；此外，Gunning等［26］利用AFM檢測新幾內亞微小卡拉膠時，得到了卡拉膠中的水溶性及非水溶性部分的結構，尤其是不溶性部分的網狀纖維素的結構。

許多食品的宏觀形態類似而微觀結構卻相差甚遠，盡管如此它們之間也存在著緊密的聯系，用原子力顯微鏡能夠觀測得到比掃描電鏡上更加精密的數據，比如比較明顯的凹凸不平、食物殘留物等細節［27］。王博等［28］在研究酶對淀粉顆粒的作用，AFM能觀察微孔的形成過程，在這一點上比掃描電子顯微鏡更加全面和詳細；而Leslaw和Juszczak等［29-30］采用AFM接觸模式深入研究了淀粉表面的形貌，結果顯示玉米淀粉和木薯粉顆粒表面比較平滑。利用原子力顯微鏡高分辨率成像的優勢不僅能夠更加細致的了解多糖物質的微觀結構，也能分析不同組成對物質宏觀性質的影響。

2.2.2蛋白質

蛋白質是食品中典型的營養成分，也是人們生存必不可少的物質，而有利用原子力顯微鏡檢測蛋白質也已經成為一種常用手段［31］。在食品加工過程中，蛋白質的結構可能隨著加工過程發生變化，原子力顯微鏡為蛋白質結構的研究提供了新的思路。郭云昌等［32］研究玉米醇溶蛋白的納米層次時，在AFM檢測下發現乙醇溶液中的醇溶蛋白是以球狀顆粒結構存在的，而云母表面的醇溶蛋白則是均勻的網狀結構，具有較好的成膜特性，由此得出網狀結構是醇溶蛋白成膜的結構基礎。

在食品加工過程中除了蛋白質的結構特征外，蛋白質凝聚和凝膠也非常重要，蛋白質凝膠的形成，是變性的蛋白質分子的聚集現象，而在聚集的過程中，如果分子間的吸引力和排斥力不平衡時，會形成相應的凝結物或者凝膠體［33］，因此只有處于一種平衡的狀態，才能形成高度有序的保水結構即為凝膠。蘆鑫等［34］利用AFM的輕敲模式觀察加熱后的β-乳球蛋白，結果發現低pH和低離子強度條件有助于β-乳球蛋白纖維體的形成；Iwasaki等［35］觀察發現70℃時原本串珠結構的肌漿球蛋絲變成了繩子結構，少量蛋白絲的結構沒有顯著變化；Yang等［36］利用AFM觀察鯰魚凝膠結構時發現球狀凝聚體和環形空洞的形成與離子滲透過膠原質時的方式有關。應用AFM還可以測定蛋白質或者其他聚合物的凝膠體系，Cecilia Elofsson等［26］將原子力顯微鏡與光學顯微鏡、流體力學相結合，觀察不同的溶液濃度、離子強度下冷凝膠乳清蛋白溶液中的微粒，發現不同處理條件下凝膠溶液的組織結構不同；Shinya Ikeda等［37］結合拉曼光譜和流體力學的實驗，對不同離子強度、pH條件下熱誘導乳清蛋白凝膠前體溶液，發現該溶液是由橢圓形顆粒組成的，并且隨著離子強度的增加，乳清蛋白由半透明凝膠轉變為不透明凝膠。因此通過原子力顯微鏡和其他技術的聯合使用對蛋白質凝膠過程中溶液的觀察，得到高分辨率的組織結構成像以及不同條件下凝膠溶液中的微粒形態等，從而更深入的分析蛋白質聚集體形成過程和作用，這對建立有利于食品品質與口感的凝膠形成體系具有十分重要的意義。

2.2.3脂質

脂質是食品中重要的大分子物質、能量的最佳儲存方式以及細胞膜的骨架結構。脂質體的理化性質一直是科學家們關注的熱點之一，脂質體的結構穩定性非常重要，趙琰等［38］利用原子力顯微鏡測定大豆卵磷脂中的脂質體的剛性和粘性并建立數學模型，結果顯示其粘連性和剛性可以定量的評價脂質體的結構穩定性；趙新軍等［39］利用AFM研究能力蔗糖溶液中二棕櫚酰磷脂酰膽堿磷脂雙分子層的結構，并分析其結構特性和楊氏模量；Patino等［40］利用AFM研究了二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二油酰磷脂酰膽堿在水-空氣界面處的結構特性，結果顯示磷脂分子層在納米級水平上的不均一性，由此使AFM在檢測納米級脂質的表面信息上更加細致；Shibata-Seki等［41］利用AFM測得觀測發現脂質體在溶液環境是直徑約200 nm～300 nm的氣球狀，而光散射顯微鏡測得其平均直徑約為180 nm，二者大體上吻合；Dufrêne等［42］通過AFM觀察支撐脂質膜的分子結構、在空氣中單層或多層膜的結構以及在水環境中的脂質雙層膜的結構等，并討論分離相單分子膜的形狀和分子結構以及成膜的組織特性。利用原子力顯微鏡檢測不同水平上脂質體的微觀結構及表面特性，為我們進一步了解脂質的屬性提供重要依據。

3　展望

原子力顯微鏡憑借它高分辨率、測樣材料廣泛、制樣簡單等特點在現代科技領域中越來越受到人們的重視，同時AFM技術也是一種“年輕”的技術，尚存在一些局限性，首先，接觸模式和輕敲模式下探針和樣品的接觸都會造成針尖的污染和變型，會影響其分辨率，如果用液體對針尖進行清理，針尖和液體之間的相互作用又會帶來新的問題；第二，盡管樣品不用特殊固定，但是一般需要加入緩沖液，存在鹽離子結晶的情況，另外AFM很難對樣品進行宏觀定位，而且針尖的曲率半徑和樣品的柔韌性也會影響儀器的分辨率，導致結果的誤差。

隨著對AFM越來越深入的研究，很多科學家就其局限性進行一定程度上的改進，大體上分為以下方面：1）碳納米管針尖衍化：碳納米管是一種納米級、分子結構完整的新型碳材料，具有較高的彈性和機械柔軟性，并且結構穩定，能夠很大程度上提高原子力顯微鏡的分辨率；2）探針的制備與功能化；3）實現納米操縱：AFM針尖作為“納米鑷”，通過在分子的特定部位上加載力大小的改變實現納米操縱；4）多功能懸臂：這類懸臂有熱電偶、納米管、近場光學探針等；5）單分子力譜是在AFM研究的基礎上逐漸發展起來的單個分子力學性質測定方法，代表著AFM應用的重要方向［43］。為了更好的在各個領域發揮作用，這種精密的分析測試儀器自身也在不斷改進的過程中，我們也將不斷的加深對原子力顯微鏡的研究，將其與不同領域相結合，不僅能夠拓展應用范圍，也可以開辟新的技術。我們將繼續研究原子力顯微鏡與其他技術的結合應用，不斷完善這項技術，讓它更好的發揮功能。

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The Research Progress of Characteristics of Atomic Force Microscopy and Its Advance in Food Science

LI Fang-fei，XIA Xiu-fang，KONG Bao-hua*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Atomic force microscopy（AFM）is a micro analysis apparatus with the characteristics of high spatial resolution，simple operation，and widely application.AFM can be used in non atmospheric environment，so it is widely used in physics，chemistry，biological materials，food，electronics and other fields.The working principle，functional characteristics and function mode of AFM were introduced，and its advance in food science research was summarized.

atomic force microscopy（AFM）；principle；functional characteristics；pattern；advance

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.052

黑龍江省應用技術研究與開發重點計劃（GA15B302）；國家自然科學基金（31471599）

李芳菲（1993—），女（漢），碩士在讀，研究方向：畜產品加工。

孔保華（1963—），女，教授，博士生導師，研究方向：畜產品加工。

2016-04-11