高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定痔清舒洗劑中大黃素和大黃酚含量

譚本仁，鄭錦坤，徐曉梅，柯治平

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東韶關(guān)512026；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州518172）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定痔清舒洗劑中大黃素和大黃酚含量

譚本仁1，鄭錦坤1，徐曉梅1，柯治平2

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東韶關(guān)512026；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州518172）

目的建立痔清舒洗劑中同時(shí)測(cè)定大黃素和大黃酚含量的方法。方法色譜柱采用Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃；進(jìn)樣量10 L。結(jié)果大黃素和大黃酚質(zhì)量濃度分別在2.70～32.34 g/mL和6.37～76.49 g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為97.40%（RSD= 0.56%，n=6）和98.59%（RSD=0.26%，n=6）。結(jié)論該法快速簡(jiǎn)單，方法可靠，專屬性強(qiáng)，可作為痔清舒洗劑的質(zhì)量控制方法。

痔清舒洗劑；大黃素；大黃酚；高效液相色譜法

痔清舒洗劑為醫(yī)院基于傳統(tǒng)中醫(yī)理論研制的中藥復(fù)方洗劑，由大黃、蒲公英、黃柏、沒藥等多味中藥組方，具有清熱解毒、燥濕止癢、行氣活血、消腫止痛的功效，主治炎性外痔、痔嵌頓，術(shù)后肛緣水腫等癥。方中大黃的主要活性成分為大黃素和大黃酚，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗(yàn)中采用高效液相色譜法，建立了該復(fù)方洗劑中大黃素和大黃酚的含量測(cè)定方法，可用于痔清舒洗劑的質(zhì)量控制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

AG-135型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；UV-2450型紫外分光光度儀（日本島津公司）；LC-2010C型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2試藥

大黃素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110756-200110）；大黃酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110796-201319，99.6%）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。痔清舒洗劑（醫(yī)院制劑室，批號(hào)為141230，150212，150407，粵藥制Z20071536）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。2.2溶液制備

供試品溶液：精密吸取樣品30 mL，置燒瓶中，精密加入乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，置水浴中加熱回流1 h，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒瓶中蒸干，用三氯甲烷強(qiáng)力振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）的混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液：精密稱取大黃素和大黃酚適量，加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）溶液制成每1 mL分別含大黃素10.78 μg和大黃酚25.50 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

陰性對(duì)照品溶液：按痔清舒洗劑工藝制成缺大黃的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。色譜見圖1。結(jié)果表明，痔清舒洗劑中其他成分對(duì)大黃素和大黃酚的測(cè)定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取大黃素對(duì)照品10.78 mg和大黃酚對(duì)照品12.80 mg，分別置100 mL容量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為大黃素母液和大黃酚母液，備用。精密量取大黃素母液3.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mL和大黃酚母液6.0，4.0，2.0，1.0，0.5 mL，分別置20 mL容量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）溶液，稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下試驗(yàn)，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。分別以大黃素和大黃酚對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得大黃素線性方程：Y=39 748 X+5 398.4（r=0.999 9），線性范圍為2.70～32.34 μg/mL；大黃酚線性方程：Y= 51 553 X+13 753（r=0.999 9），線性范圍為6.37～76.49 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定含量。結(jié)果大黃素的RSD為0.13%（n=5），大黃酚的RSD為0.31%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取痔清舒洗劑（批號(hào)為141230），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下分別于放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄的峰面積。結(jié)果大黃素及大黃酚的RSD分別為0.12%和0.34%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取6瓶痔清舒洗劑，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液及進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果大黃素及大黃酚的平均含量分別為7.90 μg/mL和20.79 μg/mL，RSD分別為0.38%和0.74%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取供試品溶液15 mL，共6份，分別精密加入大黃素對(duì)照品母液（質(zhì)量濃度為215.6 μg/mL）0.4，0.6，0.8 mL，大黃酚對(duì)照品母液（質(zhì)量濃度為255.0 μg/mL）0.8，1.2，1.6 mL，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.4含量測(cè)定

取3批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表2。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2　含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

肛腸疾病是臨床常見、多發(fā)病。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痔是由于體內(nèi)生濕積熱，濕熱下注肛門，阻滯氣機(jī)，氣滯血淤，濕熱、瘀血壅阻肛門而引發(fā)，故治療以清熱祛濕、消腫止痛為主。中藥熏洗坐浴治療是傳統(tǒng)外治法之一［1］。

痔清舒洗劑在粵北人民醫(yī)院痔瘡患者中使用了十幾年，取得了較好療效。其主藥大黃性寒、味苦，具瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的作用，蒲公英和黃柏能清熱解毒，利尿散結(jié)、清熱燥濕，沒藥則可散瘀定痛、消腫生肌，諸藥合用，共奏清熱祛濕解毒、消腫止痛之功效。臨床使用顯示，痔清舒洗劑能有效地改善炎性痔引起的腫痛癥狀及術(shù)后肛門痔水腫、疼痛等癥狀。

現(xiàn)代藥理學(xué)試驗(yàn)證明，大黃的藥理活性成分為蒽醌類衍生物［2］，主要包括蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚及大黃酸等。參考《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［3］和痔清舒洗劑的方解及對(duì)本品藥效物質(zhì)的定位和含量測(cè)定方法可行性的分析，選擇大黃中的大黃素和大黃酚作為本品含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，流動(dòng)相選用甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）時(shí)［4-6］，兩種成分的色譜峰峰形、分離度最好，且方法學(xué)考察結(jié)果顯示該測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性、準(zhǔn)確度與精密度良好，陰性對(duì)照無干擾，系統(tǒng)適用性良好。采用本試驗(yàn)所建立的HPLC含量測(cè)定方法，對(duì)3批次痔清舒洗劑進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性良好，可用于痔清舒洗劑的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善。

［1］李偉，盧興華，過石勝.中藥熏洗坐浴改善肛腸科術(shù)后疼痛水腫的療效觀察［J］.中成藥，2014，36（2）：435-437.

［2］熊興富.中藥大黃主要有效成分藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)臨床研究，2014，6（10）：143-146.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：20.

［4］閆冰，陸曉和，魏群利，等.HPLC法測(cè)定復(fù)腎康膠囊中大黃酸的含量［J］.中國(guó)藥房，2007，18（30）：2 367-2 368.

［5］張勇鋼.效液相法測(cè)定復(fù)方大黃痔瘡栓中大黃素大黃酚的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（2）：465-466.

［6］葉秀金，宋粉云.HPLC法測(cè)定清肺抑火丸中大黃的四種成分的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：646-648.

Simultaneous Content Determination of Emodin and Chrysophanol in Zhiqingshu Lotion by HPLC

Tan Benren1，Zheng Jinkun1，Xu Xiaomei1，Ke Zhiping2
（1.The Affiliated Yuebei People′s Hospital of Shantou University Medical College，Shaoguan，Guangdong，China512026；2.Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou，Guangdong，China518172）

ObjectiveTo establish a simultaneous content determination method of emodin and chrysophanol in Zhiqingshu Lotion. M ethodsSamples were analyzed on Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）.Methanol-0.1%phosphoric acid solution（85∶15）served as the mobile phase.The wavelength of detection was at 254 nm.The flow rate was 1.0 mL/min，the column temperature was set at 30℃and the injection volume was 10 μL.ResultsEmodin and chrysophanol showed good linearity in the range of 2.70-32.34 μg/mL and 6.37-76.49 μg/mL，and the average recovery rate of were 97.40%（RSD=0.56%，n=6）and 98.59%（RSD=0.26%，n=6）respectively.ConclusionThe method is quick，simple，accurate and reliable with good reproducibility，which can be used for the quality control of Zhiqingshu Lotion.

Zhiqingshu Lotion；emodin；chrysophanol；HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2016）17-0074-04

譚本仁（1973-），男，大學(xué)本科，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作，（電子信箱）1114335322@qq.com。

（2015-09-10；

2016-03-26）