高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地闊葉十大功勞葉中3種生物堿類成分的含量

趙丹，鄧祖磊，崔田，葛德洲，馬濤，來李娟

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽蚌埠233000；2.安徽省蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽蚌埠233000）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地闊葉十大功勞葉中3種生物堿類成分的含量

趙丹1，鄧祖磊2，崔田2，葛德洲2，馬濤1，來李娟1

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽蚌埠233000；2.安徽省蚌埠市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽蚌埠233000）

目的建立同時(shí)測(cè)定闊葉十大功勞葉藥材中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿的高效液相色譜（HPLC）法，并對(duì)不同產(chǎn)地闊葉十大功勞葉藥材進(jìn)行測(cè)定與比較。方法色譜柱采用Welch Ultimate LP-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（73∶27），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)346 nm，柱溫30℃。結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿色譜峰達(dá)到基線分離，質(zhì)量濃度分別在5.328～266.4 g/mL（r=0.999 9），3.68～184.0 g/mL（r=0.999 9），2.412～120.6 g/mL（r=0.999 8）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別99.17%（RSD=0.35%，n=6），98.97%（RSD=0.65%，n=6），99.36%（RSD=0.44%，n=6）。結(jié)論該法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可行、重復(fù)性好，可用于闊葉十大功勞葉藥材的質(zhì)量控制。

闊葉十大功勞葉；鹽酸小檗堿；鹽酸巴馬??；鹽酸藥根堿；高效液相色譜法

闊葉十大功勞葉為小檗科植物闊葉十大功勞Mahonia bealei（Fort.）Carr的干燥葉，始載于《本草再新》［1］，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，全國(guó)各地均有分布；其味苦、性寒，主要含生物堿類成分，具有清熱補(bǔ)虛、燥濕、解毒等作用；現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)其生物堿類成分具有抑制細(xì)菌活性、緩解腸道炎癥以及抗氧化的作用［2-7］。目前關(guān)于其有效成分的含量測(cè)定報(bào)道較少。為了更好地控制藥材質(zhì)量，保證闊葉十大功勞葉的臨床療效，筆者結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［8］對(duì)闊葉十大功勞葉中穩(wěn)定且藥理作用明確的3個(gè)生物堿類成分（小檗堿、巴馬汀、藥根堿）進(jìn)行含量測(cè)定研究，以期為闊葉十大功勞葉藥材及相關(guān)成藥的質(zhì)量控制提供思路及參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；CP225D型電子天平，BS210S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GW-UPF超純水器（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2試藥

闊葉十大功勞葉樣品于2015年3月購(gòu)自亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)本中心鄧祖磊副主任中藥師鑒定為闊葉十大功勞Mahonia bealei（Fort.）Carr干燥的葉，產(chǎn)地分別為K1為江蘇；K2，K3，K4，K5，K7為貴州；K6，K10為安徽；K8，K9為湖北；K11為云南。對(duì)照品鹽酸小檗堿（批號(hào)為110713-201212），鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)為110732-201110），藥根堿（批號(hào)為110733-200501），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑所用試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Ultimate LP-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（73∶27）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：346 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下，色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖

2.2溶液的配制

對(duì)照品溶液：精密稱取減壓干燥至恒重的鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿13.32，9.20，6.03 mg，置20 mL容量瓶，分別加甲醇-鹽酸（100∶1）溶解并稀釋至刻度，制成鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿質(zhì)量濃度分別為666，460，301.5 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液，精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇-鹽酸（100∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

供試品溶液：樣品闊葉十大功勞葉粉碎過3號(hào)篩，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，用甲醇-鹽酸（100∶1）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，放冷，過0.45 μm的濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品貯備液0.2，0.5，1，2，5，10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇-鹽酸（100∶1）至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液（含鹽酸小檗堿5.328，13.32，26.44，53.28，133.20，266.40 μg/mL；鹽酸巴馬汀3.68，9.20，18.40，36.80，92.00，184.00 μg/mL；鹽酸藥根堿2.41，6.03，12.06，24.12，60.30，120.60 μg/mL）。精密吸取系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿的回歸方程分別為Y=10.513 6 X-4.145 9，r=0.999 9（n=6）；Y=11.652 8X-3.140 5，r=0.999 9（n=6）；Y=11.096 1 X+4.095 0，r=0.999 8（n=6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在5.328～266.4 μg/mL，鹽酸巴馬汀在3.68～184.0 μg/mL，鹽酸藥根堿在2.412～120.6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿峰面積的RSD分別為0.34%，0.35%，0.85%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批號(hào)供試品（編號(hào)K11）6份，依法制備供試品溶液并測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿分別為0.734%，0.768%，1.032%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，18，24 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿的RSD分別為0.56%，1.26%，1.26%（n=7），表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密精密稱取已測(cè)含量（編號(hào)K2，鹽酸小檗堿含量為1.750 mg/g，鹽酸巴馬汀為0.591 mg/g，鹽酸藥根堿為0.360 mg/g）的十大功勞葉粉末6份，各0.25 g，精密加入對(duì)照品溶液2 mL（鹽酸小檗堿為0.220 g/L，鹽酸巴馬汀0.075 5 g/L，鹽酸藥根堿為0.056 g/L），常壓下?lián)]干溶劑，按供試品測(cè)定方法測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.4樣品含量測(cè)定

取各批次樣品，依法制備供試品溶液，平行測(cè)定2次，取平均值，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

3　討論

3.1流動(dòng)相選擇

參照文獻(xiàn)［9-11］，大都選擇乙腈和磷酸鹽作為流動(dòng)相，但是樣品的分離效果不佳，經(jīng)比較多種流動(dòng)相比例，最終選擇乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（27∶73，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0），可使3種成分達(dá)到較好的分離，基線穩(wěn)定。

3.2測(cè)定波長(zhǎng)選擇

參照文獻(xiàn)［9-11］，結(jié)合DAD光譜，發(fā)現(xiàn)3種化合物在346 nm波長(zhǎng)處都有較大吸收，因此選用346 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3提取條件選擇

本試驗(yàn)中曾考察甲醇、乙醇、甲醇-鹽酸（100∶1）作為提取溶劑，進(jìn)行回流和超聲提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果甲醇-鹽酸（100∶1）超聲提取效果最好。同時(shí)，考察了超聲處理30，45，60 min對(duì)含量的影響。結(jié)果表明，隨著超聲提取的時(shí)間延長(zhǎng)，含量也相應(yīng)增加，但是45 min和60 min含量差異較小，因此選擇超聲提取45 min。

表1　鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2　各批樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=2）

3.4生物堿含量分析

本試驗(yàn)中對(duì)11批不同產(chǎn)地的藥材進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿3種生物堿類為不同產(chǎn)地的闊葉十大功勞葉藥材的共有成分，各個(gè)產(chǎn)地之間不同生物堿的含量差異較大。單用一種生物堿來測(cè)定含量，并不能全面反映藥材的質(zhì)量。由表4可知，產(chǎn)地為安徽和云南藥材生物堿含量較高，貴州產(chǎn)的藥材含量較低，這可能與原植物的生長(zhǎng)環(huán)境、采集時(shí)間以及加工過程有關(guān)系。由圖1可知，除目前已測(cè)定的3種生物堿外，還有其他的色譜峰，提示可能還有其他生物堿。

綜上所述，2010年版《中國(guó)藥典（一部）》暫未收載闊葉十大功勞葉，且市場(chǎng)上藥材質(zhì)量參差不齊，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待建立。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定闊葉十大功勞葉中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿含量的HPLC法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，操作簡(jiǎn)便，精密度和重復(fù)性好，回收率高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可為闊葉十大功勞葉藥材的質(zhì)量控制提供可靠的參考依據(jù)。

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Simultaneous Determination of 3 Alkaloids in Mahonia Bealei Leaves from Different Producing Areas by HPLC

Zhao Dan1，Deng Zulei2，Cui Tian2，Ge Dezhou2，Ma Tao1，Lai Lijuan1
（1.Department of Pharmacy，Bengbu Medical College，Bengbu，Anhui，China233000；2.Bengbu Institute for Food and Drug Control，Bengbu，Anhui，China233000）

ObjectiveTo establish an HPLC method for simultaneous determination of 3 alkaloids（berberine，palmatine，jatrorrhizine）in Mahonia bealei（Fort.）leaves from different regions.MethodsThe analysis was carried out on a Welch Ultimate Lp-C18column with a mobile phase consisted of acetonitrile and 0.05 mol/L monopotassium phosphate solution（add phosphoric acid to pH=3.0）（27∶73）. The column temperature was 30℃and the detection wavelength was set at 346 nm and the flow rate was 1.0 mL/min.Results Therewasa good linear relationshipin therangeof 5.328-266.4μg/mL（r=0.9999），3.68-184.0μg/mL（r=0.9999），2.412-120.6 μg/mL（r=0.999 8），respectively，and the average recovery rates ware 99.17%（RSD=0.35%，n=6），98.97%（RSD= 0.65%，n=6），99.36%（RSD=0.44%，n=6），respectively.ConclusionThe method is simple and well reproducible，and can be readily utilized as a quality control method for Mahonia bealei Leaves.

Mahonia bealei（Fort.）；berberine；palmatine；jatrorrhizine；HPLC

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0033-03

蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：Byycx1554。

趙丹（1992-），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治?，（電子信箱?10502321@qq.com；鄧祖磊（1980-），男，副主任中藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作，本文通訊作者，（電話）0552-3012569。

（2016-04-01）