外用西羅莫司治療兒童結節性硬化癥血管纖維瘤的療效及安全性研究

王森分 王旭 魏京海 張建 劉元香 徐子剛

100045北京，首都醫科大學附屬北京兒童醫院皮膚科（王森分、劉元香、徐子剛），神經內科（王旭），藥學部（魏京海、張建）

外用西羅莫司治療兒童結節性硬化癥血管纖維瘤的療效及安全性研究

王森分 王旭 魏京海 張建 劉元香 徐子剛

100045北京，首都醫科大學附屬北京兒童醫院皮膚科（王森分、劉元香、徐子剛），神經內科（王旭），藥學部（魏京海、張建）

目的研究0.1%西羅莫司軟膏治療兒童結節性硬化癥血管纖維瘤的臨床療效及安全性。方法自制0.1%西羅莫司軟膏。選取結節性硬化癥面部血管纖維瘤患兒20例，予0.1%西羅莫司軟膏外用，每天2次。分別于治療4周、12周時，記錄面部血管纖維瘤嚴重程度指數（FASI評分）、皮損治療滿意度及不良反應等。治療前、治療12周時，檢測西羅莫司血藥濃度、血尿常規、凝血功能、血生化及免疫指標。結果治療前、治療4周、治療12周時，20例患兒FASI評分分別為5.750±1.175、4.400± 1.284和2.975± 1.543，治療4周、12周時的FASI評分均較治療前顯著下降（均P＜0.000 1），且治療12周時顯著低于治療4周時（P＜0.000 1）。治療12周時平均療效指數（49.87%±22.08%）顯著高于治療4周時（24.43%±10.18%），差異有統計學意義（t=7.338，P＜0.01）。治療12周時，皮損顏色明顯變淡，體積明顯縮小，瘤體數量減少，2例皮損完全消退。治療4周時，10例對紅斑減淡程度滿意，3例對皮損體積改善滿意，3例對皮損面積改善滿意。治療12周時，家長的滿意度均提高。20例患兒治療前后西羅莫司血藥濃度均低于1.0 μg/L，無嚴重系統及皮膚不良反應發生。結論0.1%西羅莫司軟膏治療結節性硬化癥血管纖維瘤療效顯著，安全性好。

結節性硬化癥；血管纖維瘤；西羅莫司；治療結果

結節性硬化癥（tuberous sclerosis complex，TSC）是一種常染色體顯性遺傳的神經皮膚綜合征，其發病率一般為1/6 000～1/10 000，受累器官主要為神經系統、皮膚、心臟、腎臟等［1?3］。面部血管纖維瘤是TSC特征性損害，可見于約80%的TSC患者，具有損容性，對患者的身心健康造成極大的影響［1?4］。目前治療面部血管纖維瘤的方法包括冷凍、磨削、激光和光動力等，這些治療方法均為有創治療，可能會遺留永久性瘢痕，且由于復發，患者需要反復治療［1?3］，故對兒童患者多采用隨診觀察。有研究報道，口服或外用西羅莫司治療結節性硬化癥皮膚癥狀，取得一定療效［2?3，5］。2015年3月以來，我們應用0.1%西羅莫司軟膏治療兒童TSC面部血管纖維瘤，獲得較好療效。

對象與方法

一、臨床資料

1.納入標準：符合2012更新版TSC診斷標準［4］；患有面部血管纖維瘤；家長或法定監護人自愿簽訂本研究知情同意書，同意本治療方案，能遵守試驗規定、規范用藥、定期隨訪。排除標準：合并免疫系統相關疾病，既往或目前口服西羅莫司治療，正在參加另一項臨床研究，依從性差或無法按照要求完成研究。

2.患者一般資料：2015年3-5月就診于北京兒童醫院皮膚科的20例TSC面部血管纖維瘤患兒納入本研究，其中男12例，女8例，年齡4～13（7.750±2.221）歲，發病年齡0～ 9歲，中位年齡（P25～P75）為2.36（0.625～3）歲。面部血管纖維瘤嚴重程度指數（facial angiofibroma severity index，FASI）評分［6］：輕度9例，中度11例。其他皮損：卵圓形或條葉狀白斑19例，鯊魚皮樣斑11例，甲周纖維瘤2例。12例有抽搐史。本研究通過北京兒童醫院醫學倫理委員會批準。

二、藥物制備及載藥率測定

1.儀器與試劑：Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；西羅莫司標準品（華北制藥股份有限公司新藥研發中心，批號：YNSN1501401），含量98.3%；乙腈、甲醇（美國Fisher公司）；黃凡士林。

2.0.1%西羅莫司軟膏制備方法：稱取西羅莫司標準品1 g，置乳缽中研成80目的粉末。取黃凡士林1 000 g，置于恒溫水浴箱加熱溶解，當溫度至60℃時，停止加熱，在不斷攪拌下，緩緩以細流加入西羅莫司粉末，邊加邊攪拌，使其充分分散。

3.西羅莫司含量測定：采用高效液相色譜法。

（1）色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB?C18，4.6 mm（內徑）×250 mm（柱長），填料內徑5 μm，批號USCL044217；紫外檢測器檢測波長278 nm；進樣量10 μl；流速1.0 ml/min；柱溫40 ℃；流動相為乙腈（100%）。

（2）對照品溶液配制：秤取西羅莫司標準品25 mg，置25 ml容量瓶中，加乙腈適量，振蕩使對照品溶解，配制成0.01、0.1、1.0、10、100、1 000 mg/L系列工作液。

（3）樣品液的配制：秤取已制備的西羅莫司軟膏1.040 3 g，置于5 ml樣品管中，加入甲醇2.5 ml，60℃恒溫水浴箱加熱，攪拌振蕩，置于冰袋迅速冷凝析出黃凡士林，待黃凡士林凝固后，收集樣品管中液體；在殘留凝固軟膏的樣品管中再加入甲醇2.5 ml，重復上述加熱冷凝過程4次后，將收集的液體經中速定性濾紙過濾，收集濾液于離心管中，加入乙腈5 ml，振蕩2 min，以1 110 ×g離心10 min，留取上清液待用。按照上述方法制備3份待測樣品。

（4）求曲線方程和相關系數：不同濃度的對照品溶液各進樣1次，記錄色譜圖，以峰面積的對數對對照品溶液濃度的對數進行線性回歸，求得曲線方程和相關系數。

（5）計算西羅莫司含量：3份樣品溶液各進樣1次，記錄峰面積，帶入標準曲線方程，計算3份樣品西羅莫司含量。

三、治療觀察

1.治療方法：皮損處清洗后，外用0.1%西羅莫司軟膏，每天2次。分別在治療4周、12周時，記錄FASI評分、皮損治療滿意度和不良反應。

2.FASI評分與臨床療效判定：FASI評分［6］由三部分評分相加組成，其中紅斑0～3分，體積0～3分，受累面積2～3分，FASI≤5為輕度，FASI＞5且＜8為中度，FASI≥8為重度。由研究者以外的兩位主治醫師及以上資格的皮膚科醫師進行FASI評分，取平均值。臨床療效判定：療效指數（%）=［（治療前FASI評分-治療后FASI評分）/治療前FASI評分］×100%。FASI25、FASI50、FASI75分別為療效指數達25%、50%、75%的患者比例。

3.滿意度評價：通過家長填寫滿意度調查表，評價面部血管纖維瘤外用0.1%西羅莫司軟膏治療后，紅斑、皮損體積、受累面積較治療前的改善程度。滿意度評價定義為，不滿意：療效指數0～25%；一般：療效指數26%～50%；滿意：療效指數51%～75%；非常滿意：療效指數76%～100%。

4.安全性指標：治療前后西羅莫司血藥濃度、血尿常規、血生化、凝血功能、免疫指標（T淋巴細胞數、輔助性T細胞數、抑制性T細胞數、CD4/CD8比值、B淋巴細胞數、自然殺傷細胞數）。記錄治療期間出現的系統不良反應（如發熱、口腔潰瘍、腹瀉等）及皮膚不良反應（如紅斑、瘙癢、疼痛、燒灼感、粉刺等）。

5.統計方法：應用SAS9.4及SPSS23.0軟件進行數據分析。單組的重復測量數據采用單組重復測量方差分析，比較3個時間點之間的差異。首先進行球性假定檢驗，如果滿足球性假定，采用單變量方差分析；如果不滿足，則采用多變量方差分析。如果時間點之間差異有統計學意義，進一步采用contrast法比較治療后2個時間點與治療前的差異，并采用Bonferroni法校正P值，將檢驗水準設為0.05/2=0.025。同一受試對象兩兩時間點間的比較采用配對t檢驗，相關分析使用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、0.1%西羅莫司軟膏藥物含量測定結果

采用高效液相色譜法測定自制0.1%西羅莫司軟膏中西羅莫司含量，求得曲線方程y=0.978 6x+5.722 3和復相關系數R=0.999 7，決定系數R2=0.999 5，模型對數據擬合程度較好。檢測西羅莫司軟膏3個樣本，含量分別為0.107 9%、0.107 6%、0.103 5%，平均含量為0.106 3%。

二、治療效果

1.治療前后臨床療效比較（表1）：治療前、治療4周、治療12周時，20例患兒FASI評分有隨時間逐漸下降的趨勢（F=80.132，P＜0.000 1）。與治療前相比，治療4周、12周時的FASI評分均顯著下降（均P＜0.000 1），且治療12周顯著低于治療4周時（P＜0.000 1）。皮損紅斑及面積FASI評分隨治療時間延長也有不同程度下降（F=361.042、17.403，均P＜0.000 1）。治療12周時，皮損顏色均明顯減淡，體積明顯縮小，瘤體數量減少，2例皮損完全消退。典型病例治療前后療效對比見圖1。

治療12周時平均療效指數顯著高于治療4周時，差異有統計學意義（t=7.338，P＜0.01）。治療前FASI評分與治療4周時療效指數呈低度線性負相關（r=-0.446，P＜ 0.05），但與治療12周時療效指數無顯著相關性（P=0.103）。患兒年齡與治療前FASI評分、治療4周、治療12周時療效指數均無明顯相關性（均P＞0.05）。治療4周時8例達FASI25以上；治療12周時，20例均達FASI25，8例達FASI50，2例達FAST75。

2.治療4、12周時患兒家長滿意度評價（表2）：治療4周時，20例中10例對紅斑減淡程度滿意，3例對皮損體積改善滿意，3例對皮損面積改善滿意；治療12周時，家長的滿意度均提高，滿意和非常滿意的評價居多，不滿意的評價減少。

三、安全性評價

治療12周時，20例患兒中15例西羅莫司血藥濃度較治療前升高，5例較治療前降低。20例患兒平均西羅莫司血藥濃度［（0.665±0.243）μg/L］高于治療前［（0.366±0.263）μg/L］，差異有統計學意義（t=3.823，P＜ 0.01），但治療前后均低于1.0 μg/L。血尿常規、血生化、凝血功能、免疫指標無明顯變化，在整個治療和隨訪過程中亦未見其他系統不良反應發生。僅1例11歲男性患兒，在外用藥1周后面部出現1～2個白頭粉刺，反復4周，在外用藥5周時癥狀消失，之后未再出現皮膚不良反應。

表1 外用0.1%西羅莫司軟膏治療20例結節性硬化癥患兒面部血管纖維瘤不同時間面部血管纖維瘤嚴重程度指數（FASI）評分及療效指數比較（x±s）

圖1 2例結節性硬化癥患兒面部血管纖維瘤外用0.1%西羅莫司軟膏治療前后比較 例1男，9歲，治療后皮損明顯縮小，顏色明顯減淡，瘤體數量減少；例2女，6歲，治療12周時面部血管纖維瘤完全消退

表2 外用0.1%西羅莫司軟膏治療20例結節性硬化癥面部血管纖維瘤患兒4周及12周時家長滿意度（例）

四、隨訪

治療12周，面部血管纖維瘤完全消退的2例患兒，分別在停藥2周、4周后復發，繼續外用0.1%西羅莫司軟膏仍有效。余18例皮損未消退患兒仍在治療隨訪中。

討 論

TSC為TSC1、TSC2基因突變導致的全身各系統均可受累的神經皮膚綜合征［1，7?9］。皮膚受累主要表現為卵圓形或條葉狀白斑、面部血管纖維瘤、鯊魚皮樣斑、甲周纖維瘤等［4，10］。約80%TSC患者會出現面部血管纖維瘤。不經治療，面部血管纖維瘤不會自行改善或消退，隨年齡增長其數量和體積也進行性增加［2?3，10］。TSC1和TSC2基因分別編碼錯構瘤蛋白和馬鈴薯球蛋白，從而抑制mTOR信號通路。mTOR信號通路通過其下游的靶蛋白核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）和蛋白質翻譯起始因子4E結合蛋白1（4EBP1），加快細胞從G1期到S期的轉換，促進細胞生長和增殖，抑制細胞凋亡。而TSC1和TSC2基因突變可增強mTOR活動，導致細胞生長的調節異常和腫瘤發生［1，8?11］。TSC 患者血管纖維瘤中的成纖維細胞產生過多的表皮生長因子、上皮調節蛋白，刺激表皮增殖，使表皮增殖速度超過凋亡速度。同時，TSC患者血管內皮生長因子表達增多，兩者共同導致面部血管纖維瘤的出現及持續增長［3，9，12］。

西羅莫司屬于大環內酯類化合物，是mTOR特異性抑制劑，可抑制 mTOR 活性［1，3，7，10?11］，阻斷細胞由G1期至S期的細胞周期進程，抑制血管內皮生長因子的釋放和內皮祖細胞、角質形成細胞的增殖［11?13］。目前已有大量文獻報道其應用于皮膚科多種疾病的治療，包括遺傳性皮膚病（如TSC、Birt?Hogg?Dubé綜合征、Cowden病、鮮紅斑痣、血管瘤等）、皮膚腫瘤（如黑素瘤、非黑素瘤細胞性皮膚腫瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、Kaposi肉瘤等）、自身免疫性或炎癥性疾病（如系統性硬化病、慢性口腔扁平苔蘚等）［2，14?16］。西羅莫司易溶于乙醇、氯仿、丙酮等有機溶劑，能夠通過表皮吸收，并進入真皮深層［3，7，14］。我們以凡士林為基質，配制0.1%西羅莫司軟膏，軟膏中西羅莫司平均含量測定結果為0.106 3%，提示藥物配制精準，符合本研究所需制劑要求。

我們外用0.1%西羅莫司軟膏治療20例TSC面部血管纖維瘤患兒12周，皮損顏色明顯減淡，體積明顯縮小，瘤體數量減少。治療4、12周時，患兒FASI評分均顯著下降。治療12周時平均療效指數達到49.87%，2例皮損完全消退。停藥復發者，繼續外用0.1%西羅莫司軟膏仍有效。皮損紅斑、體積、面積FASI評分結果及患兒治療滿意度調查提示，TSC患兒面部血管纖維瘤紅斑消退時間早，速度快，但皮損體積和面積的改善速度相對較慢。本研究20例患兒年齡與治療前FASI評分、治療4周、治療12周時療效指數均無顯著相關性，但未經治療的TSC患者，隨年齡增長面部血管纖維瘤數量和體積將進行性增加［3，10］，故其FASI評分應隨年齡增大而增大。已有文獻報道，由于增生期的腫瘤在早期時增生成分更多，對西羅莫司更敏感，故應早期開始治療［3］，年齡小者治療效果更好［14?15］。故患者年齡與面部血管纖維瘤的嚴重程度及療效的相關性分析仍需大樣本調查研究。

文獻報道，西羅莫司的檢測下限為 1.0 μg/L［7］，提示本研究中5例患兒治療12周時，西羅莫司血藥濃度低于治療前，可能由于受內源性因素影響，濃度在1.0 μg/L內的波動無臨床意義。本研究20例患兒治療前后西羅莫司血藥濃度均低于1.0 μg/L，遠低于口服西羅莫司治療TSC需要維持的血藥濃度（5 ～ 15 μg/L）［1，8，11］，且20例患兒治療12周期間血尿常規、血生化、凝血功能、免疫指標無明顯變化，無發熱、口腔潰瘍、腹瀉等系統不良反應發生。僅1例在外用藥1周后面部出現1～2個白頭粉刺，在外用藥5周時消失，之后未再出現皮膚不良反應。該結果與既往報道外用西羅莫司治療TSC面部血管纖維瘤安全性高是一致的［6?7，14?16］。

既往文獻報道，外用西羅莫司濃度多為0.1%～1%［3，14?16］，本研究入組患者均為兒童，故采用低濃度0.1%。我們的研究結果提示，0.1%西羅莫司軟膏治療兒童TSC血管纖維瘤效果顯著，安全性好。

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Efficacy and safety of topical sirolimus in the treatment of facial angiofibromas in children with tuberous sclerosis complex

Wang Senfen,Wang Xu,Wei Jinghai,Zhang Jian,Liu Yuanxiang,Xu Zigang Department of Dermatology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045,China（Wang SF,Liu YX,Xu ZG）;Department of Neurology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045,China（Wang X）;Department of Pharmacy,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045,China（Wei JH,Zhang J）.

ObjectiveTo investigate the efficacy and safety of sirolimus 0.1%ointment in the treatment of facial angiofibromas in children with tuberous sclerosis complex.MethodsSirolimus 0.1%ointment was prepared.Twenty children with tuberous sclerosis complex who had facial angiofibromas were enrolled in this study.Facial angiofibromas were topically treated with the self?prepared sirolimus 0.1%ointment twice a day for 12 weeks.The facial angiofibroma severity index（FASI）was calculated,the degree of satisfaction with the treatment was evaluated,and adverse reactions were analyzed at weeks 4 and 12.Plasma sirolimus concentrations as well as blood biochemical and immunological parameters were measured,blood coagulation activity was evaluated,and routine blood tests as well as urine tests were performed at baseline and week 12.ResultsThe FASI of patients significantly decreased at weeks 4（4.400 ±1.284）and 12（2.975±1.543）compared with that at baseline（5.750 ± 1.175,bothP＜ 0.000 1）,and was significantly lower at week 12 than at week 4（P＜0.000 1）.The efficacy index was 49.87% ± 22.08%at week 12,significantly higher than that at week 4（24.43% ±10.18%,t=7.338,P＜0.01）.The color,size and number of lesions significantly decreased in all the patients,and facial angiofibromas completely disappeared in 2 patients at week 12.At week 4,10 parents were satisfied with the improvement of erythema,3 parents with that of lesion volume,and 3 parents with that of lesion area.The degree of parent satisfaction increased at week 12 in all the cases.The blood concentration of sirolimus was lower than 1.0 μg/L both before and after the treatment.No severe systemic or local adverse reactions were noted in these patients.ConclusionSirolimus 0.1%ointment is markedly effective and safe for the treatment of facial angiofibromas in patients with tuberous sclerosis complex.

Tuberous sclerosis;Angiofibroma;Sirolimus;Treatment outcome

Xu Zigang,Email:zigangxu@yahoo.com

徐子剛，Email：zigangxu@yahoo.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.005

北京市科委“首都臨床特色應用研究”專項課題（Z161100000516070）；北京市醫院管理局臨床醫學發展專項（ZYLX201601）

Fund programs:the Capital Clinical Characteristic Application Research Program of Beijing Municipal Science and Technology Commission（Z161100000516070）;Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support（ZYLX201601）

2015?09?29）

（本文編輯：周良佳 顏艷）