反常性痤瘡一家系調查及致病基因突變分析

張曉峰 蘇惠春 覃云飛 李誠讓 肖學敏 徐浩翔 王寶璽

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所皮膚科（張曉峰、蘇惠春、李誠讓、肖學敏、徐浩翔、王寶璽）；南寧市第二人民醫院皮膚科（覃云飛）

反常性痤瘡一家系調查及致病基因突變分析

張曉峰 蘇惠春 覃云飛 李誠讓 肖學敏 徐浩翔 王寶璽

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所皮膚科（張曉峰、蘇惠春、李誠讓、肖學敏、徐浩翔、王寶璽）；南寧市第二人民醫院皮膚科（覃云飛）

目的研究一個反常性痤瘡家系患者γ分泌酶基因突變情況。方法收集1個反常性痤瘡患者家系資料，該家系共4代30人，患者12例，其中在世患者9例。提取先證者及其有關親屬8例（患者5例、非患者3例）外周血DNA，采用PCR擴增NCSTN、PSEN1、PSENEN、Aph1基因編碼區的全部外顯子及其側翼序列，測序并分析。選取100例健康人作為對照。結果基因檢測發現，5例患者外周血DNA中的PSENEN基因發生c.229_230insCACC插入突變，導致氨基酸翻譯過程中移碼，不能形成功能正常的PSENEN蛋白，家系中3例正常親屬及100例健康對照均無該突變。結論反常性痤瘡家系存在1個新的插入突變，即PSENEN c.229_230insCACC突變，可能是引起該家系反常性痤瘡患病的分子機制。

突變；基因，PSENEN；反常性痤瘡；γ分泌酶

反常性痤瘡（ance inversa，AI）發病機制不明確，患者中有30%～40%有家族史，該病以常染色體顯性方式遺傳，伴不完全外顯［1］。2010年，王寶璽等［2］首次報道了γ分泌酶不同亞基的突變可導致家族性AI。γ分泌酶是一個膜內切蛋白酶復合體，包括Nicastrin（NCSTN）、早老素1（PSEN1）、早老素增強子2（PSENEN）、前咽缺陷蛋白（Aph1）4種組分［3］，其中，NCSTN、PSEN1、PSENEN突變可導致家族性AI［2］。隨后，多個研究報道了AI患者的γ分泌酶基因突變［4?8］。我們通過PCR擴增及堿基測序，首次報道1個PSENEN突變的AI家系。

一、家系調查

現場調查1個來自廣西的反常性痤瘡家系，該家系共4代30人，患者12例，其中在世患者9例。檢測突變的家族成員8例，其中先證者（Ⅲ7）及Ⅱ7、Ⅲ1、、Ⅲ6、Ⅲ12為患者，Ⅱ5、Ⅲ8、Ⅳ5為正常親屬（圖1）。先證者，男，52歲，30余年前患者逐漸出現面、頸、腋窩、臀部、腹股溝等毛囊性丘疹、結節、膿腫，并逐漸形成竇道及瘢痕，未規律治療，皮損遷延不愈。家族中多人出現類似癥狀，輕重不一。體檢：頭皮、臀部膿腫、竇道，面部、腋窩、臀部瘢痕（圖2）。否認系統性疾病，父親有類似皮損，已去世，父母非近親結婚，家族內多人有類似皮損。

二、方法

1.基因組DNA提?。撼槿?例患者及其3例親屬外周血2 ml，提取基因組DNA（DNA Blood Mini試劑盒，51104，德國Qiagen公司）。同時在數據庫中隨機選擇100例無關健康人基因組DNA作對照。本研究通過中國醫學科學院皮膚病研究所醫學倫理委員會批準，患者及親屬均簽署知情同意書。

2.PCR引物設計：根據NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫提供的 NCT、PSEN1、PSENEN序列，利用Primer5軟件設計特異性引物，擴增先證者NCT、PSEN1、PSENEN基因編碼區全部外顯子及其側翼序列，引物由上海立菲生物技術有限公司合成。

3.PCR反應及測序：PCR反應體系50 μl，含基因組DNA 1 μl，上下游引物各1 μl（20 mmol/L），使用Progema GoTaq? Green Master Mix（2 ×）25 μl，ddH2O 22 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min后，進行以下14個循環：95℃變性35 s，63℃退火45 s（第2循環起每個循環以后退火溫度降低0.5℃），72℃延伸75 s，接著進行26個循環：94℃ 變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸75 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR產物純化后由上海立菲生物技術有限公司完成測序。所有測序結果用NCBI blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）等數據庫進行分析比對。

三、結果

1.AI患者臨床表現分析：先證者（Ⅲ7）皮損范圍最大，膿腫及瘢痕最多，腋窩皮損較重（圖2）。病情最輕的是Ⅲ12，僅有少量毛囊性丘疹（圖3）。其余患者病情嚴重程度介于Ⅲ12和Ⅲ7之間。

圖1 反常性痤瘡家系圖 *為檢測基因突變者

圖4 DNA測序結果 PSENEN c.229_230insCACC（箭頭處為突變堿基位點）

2.AI患者基因突變分析：以先證者基因組DNA為模板，根據上述條件PCR擴增出NCSTN、PSENEN、PSEN1基因所有外顯子的編碼序列及側翼序列。突變分析比對發現PSENEN基因第4外顯子插入CACC 4個堿基，即出現插入突變PSENEN c.229_230insCACC（p.I77HfsX45）（圖 4），導 致PSENEN翻譯中產生移碼，在突變下游45個密碼子處終止翻譯。另4例患者均存在該突變，而3例非患者（Ⅱ5、Ⅲ8、Ⅳ5）不具有該突變，在100例健康對照中也不存在。

四、討論

AI又稱為毛囊閉鎖三聯征，三聯征指的是聚合性痤瘡、化膿性汗腺炎和頭皮膿腫性穿掘性毛囊周圍炎同時出現。但臨床觀察發現，只有少部分AI患者同時具有三聯征的臨床表現，皮損較多累及腋下、乳房下、腹股溝、外生殖器及肛周等頂泌汗腺分布密集的部位。而且，AI發病年齡與尋常痤瘡相似，但病程、好發部位、皮損特點等與尋常痤瘡有明顯差異，故近年來較多學者建議以“反常性痤瘡”代替“毛囊閉鎖三聯征”。PSENEN蛋白是γ分泌酶的亞基之一，PSENEN亞基具有3個跨膜片段（transmembrane segment，TM），其不同功能域分別與PSEN1和NCSTN相互作用，促進γ分泌酶PSEN1亞基的催化作用并協助γ分泌酶復合體的組裝［3］。PSENEN蛋白的功能障礙可能影響γ分泌酶的活性及功能并產生相應效應。近年來，γ分泌酶突變的AI家系報道并不少見，但大多數突變位于NCSTN亞基，PSENEN突變的家系報道較少［2，5］。對于突變患者的臨床表型，有研究報道，NCSTN突變的AI患者皮損主要出現在面部、頸后、背部、臀部等非典型部位，腋窩皮損較輕［2］，存在NCSTN或PSENEN突變的患者頸后部更易出現皮損［9］。本家系中，各患者之間病情輕重變化大，該家系中先證者腋窩、頸后的各個部位皮損均較嚴重，但其他患者腋窩、頸后皮損較輕，故具有PSENEN突變的AI患者皮損特點是否與NCSTN突變的AI患者存在相關性，尚需收集更多PSENEN突變的AI家系進一步研究。對于PSENEN突變家系的突變位置，既往報道的突變集中于PSENEN基因第3、4外顯子，均為插入缺失堿基引起移碼突變，其中2例突變位點為相鄰堿基PSENEN基因編碼區第66、67堿基處，提示該位置為熱點突變區域，相應位點翻譯的氨基酸區域可能為重要功能域。本文家系報道的突變同樣為PSENEN的第4外顯子上的移碼突變，編碼區第229位堿基后插入CACC 4個堿基，使得PSENEN翻譯時產生移碼，不能形成正常的PSENEN蛋白，導致蛋白功能障礙，進而可能引起γ分泌酶復合體功能受到影響，造成下游相關信號轉導通路的級聯反應，產生一系列效應，這可能是AI發病的分子機制之一。另外，該突變位于TM3中，該區域氨基酸疏水基團恰好是PSENEN與PSEN1的相互作用的重要區域［3］，提示該位置發生突變后可能影響PSENEN與PSEN1的相互作用。

［1］ Revuz J.Hidradenitis suppurativa［J］.Presse Med,2010,39（12）:1254?1264.DOI:10.1016/j.lpm.2010.08.003.

［2］ Wang B,Yang W,Wen W,et al.Gamma?secretase gene mutations in familial acne inversa［J］.Science,2010,330（6007）:1065.DOI:10.1126/science.1196284.

［3］ Bai XC,Yan C,Yang G,et al.An atomic structure of human γ?secretase［J］.Nature,2015,525（7568）:212?217.DOI:10.1038/nature14892.

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［7］ Jiao T,Dong H,Jin L,et al.A novel nicastrin mutation in a large Chinese family with hidradenitis suppurativa［J］.Br J Dermatol,2013,168（5）:1141?1143.DOI:10.1111/bjd.12135.

［8］焦婷,韓長元,張力,等.反常性痤瘡一家系臨床表型及基因突變研究［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（11）:814?815.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.011.015.Jiao T,Han CY,Zhang L,et al.Clinical and genetic analysis of a pedigree with acne inversa［J］.Chin J Dermatol,2014,47（11）:814?815.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.011.015.

［9］ Wang B.γ?secretase mutation and consequently immune reaction involved in pathogenesis of acne inversa［J］.J Investig Dermatol Symp Proc,2015,17（1）:25.DOI:10.1038/jidsymp.2015.21.

Acne inversa in a family:a clinical survey and genetic mutation analysis

Zhang Xiaofeng,Su Huichun,Qin Yunfei,Li Chengrang,Xiao Xuemin,Xu Haoxiang,Wang Baoxi
Department of Dermatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042，China（Zhang XF,Su HC,Li CR,Xiao XM,Xu HX,Wang BX）;Department of Dermatology,Second People′s Hospital of Nanning City,Nanning 530031,China（Qin YF）

ObjectiveTo analyze γ ?secretase gene mutations in a pedigree with acne inversa.MethodsClinical data were collected from a pedigree with acne inversa,which contained 30 members spanning 4 generations.Of these members,12 were affected by acne inversa,and 9 of the affected members were alive.Peripheral blood DNA was obtained from the proband,his seven relatives（including 4 affected and 3 unaffected members）,and 100 unrelated healthy human controls.PCR was performed to amplify all the coding exons and their flanking sequences of the NCSTN,PSEN1,PSENEN,Aph1 genes followed by DNA sequencing.ResultsA heterozygous insertion mutation（c.229_230insCACC）of the PSENEN gene,which led to translational frameshifting and resulted in dysfunciton of the PSENEN protein,was detected in all the 5 patients,but not in unaffected members or healthy controls.ConclusionThere is a novel heterozygous insertion mutation c.229_230insCACC in the PSENEN gene,which may be the molecular basis of acne inversa in this family.

Mutation;Genes,PSENEN;Acne inversa;gamma?Secretase

Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

王寶璽，Email：wangbx@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.016

國家自然科學基金（81101207、81472905、81472872）；北京協和醫學院協和青年基金（33320140136）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81101207,81472905,81472872）;PUMC Youth Fund（33320140136）

2015?09?02）

（本文編輯：吳曉初）